雙側(cè)黑質(zhì)注射脂多糖引起大鼠迷走神經(jīng)背核膽堿能標(biāo)志物降低和便秘

張 悅 鄭麗飛 宋 瑾 樊瑞芳 陳長(zhǎng)亮 朱進(jìn)霞

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，北京100069)

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種好發(fā)于中老年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，常伴有消化系統(tǒng)方面的功能異常，如便秘等［1］，其主要病理特征為中腦黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元缺失。近年來研究［2］表明腦內(nèi)炎性反應(yīng)可能是PD的一個(gè)主要致病因素，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性反應(yīng)是PD病變過程的重要組成部分。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是一種以氨基苷為組成單位的磷脂，構(gòu)成革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分［3］，是一種很強(qiáng)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活劑，可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，釋放致炎因子和細(xì)胞毒性因子導(dǎo)致多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性［4］。Herrera 等［5］認(rèn)為L(zhǎng)PS注入黑質(zhì)可以作為研究炎性反應(yīng)對(duì)DA系統(tǒng)影響的最佳動(dòng)物模型。

DA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，主要由中腦黑質(zhì)產(chǎn)生，沿黑質(zhì)—紋狀體投射系統(tǒng)分布，儲(chǔ)存于紋狀體。臨床研究［6］發(fā)現(xiàn)PD患者黑質(zhì)中DA能神經(jīng)元缺失伴有內(nèi)源性DA含量的改變，而胃腸動(dòng)力會(huì)隨之發(fā)生變化。DA對(duì)胃腸功能具有調(diào)節(jié)作用，如可以調(diào)節(jié)鈉的吸收［7］，刺激消化道上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)［7－8］，抑制胃腸蠕動(dòng)［9－11］以及黏膜血流量［12］。

DA除了在黑質(zhì)—紋狀體系統(tǒng)有大量分布外，在中樞其他核團(tuán)也有DA能神經(jīng)元的存在，如下丘腦［13］、孤束核、迷走運(yùn)動(dòng)背核(dorsal motor nucleus of the vagus，DMV)［14－15］等，支配上消化道的迷走神經(jīng)副交感節(jié)前纖維大部分來源于DMV。支配胃腸運(yùn)動(dòng)的DMV內(nèi)含有膽堿能神經(jīng)元和 DA 能神經(jīng)元［16－17］，并且研究［18－19］發(fā)現(xiàn)PD患者DMV部位的神經(jīng)元也有退行性表現(xiàn)。

本研究通過制作LPS誘導(dǎo)的PD大鼠模型，觀察模型組和對(duì)照組大鼠DMV中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase，ChAT)的分布情況，并檢測(cè)該模型大鼠排便情況，以期為PD患者便秘的發(fā)病機(jī)制提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 LPS處理PD模型大鼠的制備

選取20只雄性SD大鼠(首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2012－0001。體質(zhì)量為250～300 g，經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)許可，動(dòng)物在室溫條件，正常更替光照，24h食水供應(yīng)，采用數(shù)字表法將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，LPS處理組大鼠12只、對(duì)照組8只。

模型制備:LPS處理組大鼠12只，用水合氯醛進(jìn)行麻醉(0.4 g/kg)后，將大鼠頭部固定于立體定位儀，顱骨暴露出2點(diǎn)(黑質(zhì)坐標(biāo):前囟后5.6 mm，旁開±2.0 mm，深度7.5 mm)，從這2點(diǎn)注入脂多糖(lipoplysaccharide，LPS，購(gòu)自美國(guó) Sigma公司)，每點(diǎn)注入2 μL，濃度為2 g/L。飼養(yǎng)3周后成模。

1.2 行為學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成模后進(jìn)行行為學(xué)觀察記錄，每天從15點(diǎn)到16點(diǎn)對(duì)大鼠的攝食量、飲水量、體質(zhì)量及糞便進(jìn)行觀測(cè)，連續(xù)觀察1周并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 HE 染色

將黑質(zhì)部位的切片晾干后用蒸餾水洗凈，蘇木精染色3～10 min，自來水洗去多余的蘇木精。鹽酸乙醇分色10 s，自來水漂洗20 min，使蘇木精藍(lán)化細(xì)胞核呈藍(lán)色。蒸餾水清洗后，以1%伊紅染色3 min，蒸餾水洗去多余伊紅。上行梯度乙醇脫水，組織依次通過70%、80%、90%、95%乙醇各1 min，然后2次進(jìn)入100%乙醇脫水各5 min。用二甲苯透明2次各5 min，封片照相。

1.4 免疫組織化學(xué)

取材:成模大鼠及對(duì)照組大鼠用4%多聚甲醛進(jìn)行灌流固定，完成后取腦，將腦組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中，次日將組織浸泡于15%蔗糖溶液中，第3日換至30%蔗糖溶液中，梯度脫水。

待腦組織完全脫水后，按黑質(zhì)和DMV所在部位切塊包埋，冰凍切片機(jī)切厚度為20 μm腦片，漂片于多聚賴氨酸處理的載玻片上，過夜晾干。

DMV區(qū)域的切片，經(jīng)檸檬酸鹽緩沖液中微波抗原修復(fù)后，自然降至室溫。先后經(jīng)PBST緩沖液、甘氨酸、PBST洗片。用5%驢血清封閉50 min，選用一抗分別為酪氨酸羥化酶(TH，小鼠抗大鼠，1∶5 000稀釋，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT，山羊抗大鼠，1∶100稀釋，購(gòu)自Abcam公司)，4℃過夜孵育。15～16 h后取出組織切片室溫放置1 h，PBST洗3次。滴加二抗(驢抗山羊、驢抗小鼠，購(gòu)自Invitrogen公司)，孵育 2 h后滴加 DAPI，5 min后PBST洗片，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察、照相。

黑質(zhì)區(qū)域的切片則只選用酪氨酸羥化酶(TH，小鼠抗大鼠，1∶5 000稀釋，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)一抗進(jìn)行單標(biāo)染色，其他步驟不變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(ˉx±SE)表示，結(jié)果來自3批獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果中的“n”代表動(dòng)物只數(shù)。組間比較行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠黑質(zhì)部位注射LPS的帕金森動(dòng)物模型鑒定

TH是DA合成的限速酶，可以作為DA能神經(jīng)元的標(biāo)志物。從HE染色結(jié)果(圖1A和B)可以看出，LPS大鼠黑質(zhì)部位的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，并伴有膠質(zhì)細(xì)胞的增多。免疫組織化學(xué)的結(jié)果顯示LPS大鼠黑質(zhì)部位的TH免疫陽性神經(jīng)元的數(shù)量和熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組(圖1C和D)。以上結(jié)果表明LPS大鼠黑質(zhì)部位的DA能神經(jīng)元減少，由此可見，LPS處理的PD大鼠模型造模成功。

圖1 HE染色及TH免疫陽性神經(jīng)元在LPS組和對(duì)照組大鼠黑質(zhì)的分布Fig.1 HE staining and tyrosine hydroxylase(TH)immunoreactivity in the substantia nigra(SN)of LPS and control rats

2.2 LPS組與對(duì)照組大鼠行為學(xué)比較

LPS大鼠在成模后檢測(cè)了其每天的體質(zhì)量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔圖2A，對(duì)照組:(6.02±0.84)g，LPS 組:(7.12 ±0.80)g，n=6，P=0.36)〕。每天食物的攝入量〔對(duì)照組:(26.70±1.02)g，LPS組:(27.98±0.84)g，n=6，P=0.36〕和攝水量〔對(duì)照組:(46.13±2.78)g，LPS組:(49.23 ±2.40)g，n=6，P=0.42〕2組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。但其糞便濕質(zhì)量〔對(duì)照組:(53.80±2.45)g，n=8，LPS組:(43.95±2.98)g，n=9，P ＜0.05〕和含水量〔對(duì)照組:(17.31 ±1.59)g，n=8，LPS 組:(10.68 ±1.72)g，n=9，P＜0.05〕，LPS組明顯低于對(duì)照組(圖2C)。此外，從大鼠排出的糞便情況也可以看出LPS組大鼠排出的糞便量明顯少于對(duì)照組，且比較干燥(圖2D)。以上結(jié)果提示LPS大鼠出現(xiàn)便秘癥狀。

2.3 TH、ChAT在LPS組和對(duì)照組大鼠DMV中的分布差異

眾所周知，DMV在調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力方面發(fā)揮著重要的作用。本研究用免疫組織化學(xué)的方法觀察了TH和ChAT(膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志物)在大鼠DMV中的分布。TH(紅色)免疫陽性神經(jīng)元和纖維主要分布在DMV及孤束核，ChAT(綠色)免疫陽性神經(jīng)元和纖維主要分布在DMV及舌下神經(jīng)核(圖3)。從圖3中可以看出對(duì)照組和LPS模型組TH和ChAT在背側(cè)延髓的分布情況一致。但是DMV中的TH免疫陽性神經(jīng)元和纖維的熒光強(qiáng)度及數(shù)量在LPS組明顯高于對(duì)照組;而ChAT免疫陽性神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度及數(shù)量則低于對(duì)照組。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過用LPS損毀黑質(zhì)部位DA能神經(jīng)元制備的PD大鼠模型，觀察到LPS大鼠出現(xiàn)便秘情況、DMV部位的TH免疫熒光強(qiáng)度增強(qiáng)而ChAT熒光強(qiáng)度明顯減弱。

DMV在調(diào)節(jié)胃腸功能方面發(fā)揮著重要的作用，如胃腸的運(yùn)動(dòng)功能。DMV中含有多種神經(jīng)元，其中大多數(shù)是膽堿能神經(jīng)元，也含有其他神經(jīng)元如DA能神經(jīng)元。TH是合成DA的限速酶，存在于DA能細(xì)胞內(nèi)，可用于標(biāo)記DA能細(xì)胞;DA能神經(jīng)元釋放的DA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有強(qiáng)烈的舒張平滑肌和舒血管的作用，可抑制胃腸道的緊張性。ChAT是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志物，可標(biāo)記膽堿能神經(jīng)元。膽堿能神經(jīng)元釋放的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)則是一種常見的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，具有刺激胃腸平滑肌收縮和促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)的作用［20］;從本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可以看出在大鼠DMV有TH和ChAT免疫陽性神經(jīng)元的存在，而它們?cè)诜植己凸δ苌洗嬖诘牟町愋蕴崾究赡軐?duì)胃腸功能調(diào)節(jié)發(fā)揮著不同的作用。

本實(shí)驗(yàn)中，用LPS損毀黑質(zhì)炎性反應(yīng)模型大鼠的黑質(zhì)部位DA能神經(jīng)元較對(duì)照組明顯減少并伴有膠質(zhì)細(xì)胞的增生，標(biāo)志著LPS已通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞使DA能神經(jīng)元退化，動(dòng)物模型造模成功。LPS大鼠出現(xiàn)排出的糞便量明顯減少且糞便較干燥，提示LPS大鼠出現(xiàn)了類似于PD患者的便秘的表現(xiàn)。便秘可以是2種主要因素引起，一是運(yùn)動(dòng)障礙;二是結(jié)腸對(duì)水分的重吸收增多。為了探索LPS大鼠便秘的原因，筆者研究了支配胃腸運(yùn)動(dòng)的DMV部位DA的標(biāo)志物TH和膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志物ChAT的免疫反應(yīng)性變化，發(fā)現(xiàn)該部位TH免疫熒光強(qiáng)度顯著增高而ChAT則明顯降低。抑制性神經(jīng)遞質(zhì)DA在DMV部位的增多，一方面可通過與膽堿能神經(jīng)元突觸前膜上的D2受體結(jié)合［21］，進(jìn)而抑制該神經(jīng)元釋放ACh到消化道部位，另一方面由DMV直接釋放到胃腸部位，引起胃腸部位的DA增多，這兩條通路都可抑制胃腸動(dòng)力。相反，興奮性神經(jīng)元遞質(zhì)ACh在LPS大鼠DMV部位的減少，從而使直接釋放到胃腸的ACh也可能減少，引起胃腸動(dòng)力興奮的作用減弱。胃腸動(dòng)力興奮作用的減弱和抑制作用的增強(qiáng)，這2種情況都使消化道整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間延長(zhǎng)，從而導(dǎo)致大鼠排出的糞便量減少。由于消化道動(dòng)力的減弱，使糞便在結(jié)腸部位停留的時(shí)間延長(zhǎng)，糞便中的水分可能被結(jié)腸黏膜吸收增多，出現(xiàn)大便干燥硬結(jié)的情況，最終LPS大鼠表現(xiàn)出類似于PD患者的便秘情況。關(guān)于LPS大鼠結(jié)腸黏膜對(duì)水吸收功能的變化還有待進(jìn)行進(jìn)一步的研究。上述結(jié)果的產(chǎn)生可能是由于黑質(zhì)部位DA能神經(jīng)元損傷之后通過直接或間接地神經(jīng)纖維的聯(lián)系使DMV部位的神經(jīng)元發(fā)生可塑性改變，進(jìn)而導(dǎo)致胃腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂，即胃腸動(dòng)力減弱。該結(jié)果與筆者之前在6－OHDA大鼠觀察到的結(jié)果［16，22］一致。

綜上所述，LPS破壞大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元后，經(jīng)一系列神經(jīng)可塑性變化，導(dǎo)致DMV處的DA含量增多、ACh含量減少。從而使DMV通過神經(jīng)纖維傳遞到胃腸的DA增多及ACh減少，進(jìn)而引起大鼠出現(xiàn)便秘。但由SN神經(jīng)元損傷引起DMV部位神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生變化的機(jī)制尚不明確，還有待于進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

［1］Ziemssen T，Reichmann H.Non－motor dysfunction in Parkinson’s disease［J］.Parkinsonism Relat Disord，2007，13(6):323－332.

［2］Qian L，F(xiàn)lood P M，Hong J S.Neuroinflammation is a key player in Parkinson disease and a prime target for therapy［J］.J Neural Transm，2010，117(8):971－979.

［3］Shiratsuch H，Basson M D.Differential regulation of monocyte/macrophage cytokine production by pressure［J］.Am J Surg，2005，190(5):757－762.

［4］Liu B，Du L，Hong J S.Naloxone protects rat dopaminergic neurons against inflammatory damage through inhibition of microglia activation and superoxide generation［J］.J Pharmacol Exp Ther，2000，293(2):607－617.

［5］Herrera A J，Casta?o A，Venero J L，et al.The single intranigral injection of LPS as a new model for studying the selective effects of inflammatory reactions on dopaminergic system［J］.Neurobiol Dis，2000，7(4):429－447.

［6］Fumagalli F，Gainetdinov R R，Valenzano K J，et al.Role of dopamine transporter in methamphetamine－induced neurotoxicity:evidence from mice lacking the transporter［J］.J Neurosci，1998，18(13):4861－4869.

［7］Finkel Y，Eklof A C，Granquist L，et al.Endogenous dopamine modulates jejunal sodium absorption during high－salt diet in young but not in adult rats［J］.Gastroenterolo，1994，107(3):675－679.

［8］Zhang X H，Zhang X F，Zhang J Q，et al. β－adrenoceptors，but not dopamine receptors，mediate dopamine－induced ion transport in late distal colon of rats［J］.Cell Tissue Res，2008，334(1):25－35.

［9］Zhang X H，Guo H，Xu J D，et al.Dopamine receptor D1 mediates the inhibition of dopamine on the distal colonic motility［J］.Transl Res，2012，159(5):407－414.

［10］Haskel Y，Hanani M.Inhibition of gastrointestinal motility by MPTP via adrenergic and dopaminergic mechanisms［J］.Dig Dis Sci，1994，39(11):2364－2367.

［11］米新亮，李蘊(yùn)，郭華，等.5－HT3/4受體在內(nèi)源性多巴胺調(diào)節(jié)胃動(dòng)力中的作用［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31(2):217－221.

［12］Szabo S.Dopamine disorder in duodenal ulceration［J］.Lancet，1979，2(8148):880－882.

［13］Vucetic Z，Reyes T M.Central dopaminergic circuitry controlling food intake and reward:implications for the regulation of obesity［J］.Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med，2010，2(5):577－593.

［14］Hayakawa T，Takanaga A，Tanaka K，et al.Distribution and ultrastructure of dopaminergic neurons in the dorsal motor nucleus of the vagus projecting to the stomach of the rat［J］.Brain Res，2004，1006(1):66－73.

［15］Zheng Z，Travagli R A.Dopamine effects on identified rat vagal motoneurons［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2007，292(4):G1002－G1008.

［16］Zheng L F，Wang Z Y，Li X F，et al.Reduced expression of choline acetyltransferase in vagal motoneurons and gastric motor dysfunction in a 6－OHDA rat model of Parkinson’s disease［J］.Brain Res，2011，1420:59－67.

［17］Cai Q Q，Zheng L F，F(xiàn)an R F，et al.Distribution of dopamine receptors D1－ and D2－inmunoreactive neurons in the dorsal motor nucleus of vagus in rats［J］.Auton Neurosci，2013，176(1－2):48－53.

［18］Phillips R J，Walter G C，Wilder S L，et al.Alpha－synuclein－immunopositive myenteric neurons and vagal preganglionic terminals:autonomic pathway implicated in Parkinson’s disease?［J］.Neuroscience，2008，153(3):733－750.

［19］Braak H，Del Tredici K，Rüb U，et al.Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease［J］.Neurobiol Aging，2003，24(2):197－211.

［20］李林，茹立強(qiáng).大鼠腸道內(nèi)ACh能、SP、VIP－肽能和NO能神經(jīng)的分布模式及相互關(guān)系［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，38(5):575－580.

［21］Takahashi T，Kurosawa S，Wiley J W，et al.Mechanism for the gastrokinetic action of domperidone In vitro studies in guinea pigs［J］.Gastroenterology，1991，101(3):703－710.

［22］Tian Y M，Chen X，Luo D Z，et al.Alteration of dopaminergic markers in gastrointestinal tract of different rodent models of Parkinson’s disease［J］.Neuroscience，2008，153(3):634－644.