流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠肝纖維化時(shí)機(jī)體免疫細(xì)胞的變化

劉 新 婁金麗* 白 麗 張曉慧 丁 美 段鐘平

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院臨檢中心，北京100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院人工肝中心，北京100069)

肝纖維化是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)等各種病因引起的慢性肝損傷發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)病理過(guò)程，阻斷或者逆轉(zhuǎn)肝纖維化是治療慢性肝病的重要目標(biāo)［1］。就HBV感染而言，世界上每年約有3.5億人感染HBV，其中100多萬(wàn)人死于肝病末期［2］，因此研究免疫因素對(duì)纖維化的調(diào)節(jié)作用，對(duì)控制纖維化的進(jìn)展、控制慢性肝損傷的病死率有重要意義。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的外周血和肝組織浸潤(rùn)的Tregs、NK1.1+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞和 CD8+細(xì)胞頻率的變化，以闡述肝臟局部浸潤(rùn)肝纖維化時(shí)不同免疫細(xì)胞的變化，初步探討Tregs等免疫細(xì)胞在纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 小鼠分組與肝纖維化模型的建立

無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK-(軍)2007-004〕。采用數(shù)字表法隨機(jī)分成2組，分別為對(duì)照組和肝纖維化組，每組5只。肝纖維化組腹腔注射CCl4(濃度從2% 逐漸增加至30% ，0.1 mL/10 g，2次/周，6周)，對(duì)照組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.2 血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)

眼球采血分離血清，生化法檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)。

1.3 病理學(xué)觀察

用10%中性甲醛固定肝組織，包埋、切片、行 HE染色及Masson染色，顯微鏡下觀察肝組織炎性反應(yīng)及纖維化程度。

1.4 肝組織非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的分離

常規(guī)取小鼠肝臟，研磨肝組織后，加IV型膠原酶(終濃度0.5 mg/mL，美國(guó) Sigma 公司)、DNaseⅠ (終濃度50～100 U/mL，美國(guó)Sigma公司)，放震蕩孵箱(37℃，40 min)進(jìn)行消化、離心細(xì)胞并進(jìn)行沖洗。用Ficoll液分離，取霧狀白膜層細(xì)胞，洗后計(jì)數(shù)細(xì)胞稀釋至106/mL以備染色，進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

小鼠外周血細(xì)胞Foxp3抗體胞內(nèi)染色需固定破膜，按試劑說(shuō)明書(shū)操作程序進(jìn)行染色。肝的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞提取后，鏡下計(jì)數(shù)調(diào)整至合適的濃度，取大約105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色，不需要裂解紅細(xì)胞，方案與血液的染色方案基本相同。所用流式細(xì)胞儀FC500(Beckman Coulter)，所用抗體Anti-mouse CD4 FITC(clone:GK1.5)、Anti-mouse CD8a PE-Cy7(clone:53-6.7)、Antimouse CD25 FE-Cy5(clone:PC61.5)、Anti-mouse Foxp3 PE(clone:NRRF-30)、Rat IgG2a K Isotype Control PE、NK1.1 PE及固定破膜劑均來(lái)自于eBioscience公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉ±s)表示，Levene’s分析組間方差齊性，符合方差齊性的采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊采用校正t檢驗(yàn);肝臟和血液中的差異分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的建立

1)肝功能的改變

肝纖維化組小鼠血清ALT〔(567.33 ±242.53)U/L〕高于對(duì)照組〔(41.63 ±18.40)U/L，P ＜0.05，n=3〕。

2)肝組織病理學(xué)改變

肝臟大體觀，肝纖維化組小鼠肝組織觸之較對(duì)照鼠肝臟稍硬，表面和切面呈彌漫小結(jié)節(jié)，有細(xì)顆粒感。HE染色顯示纖維化組肝細(xì)胞索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞或消失，纖維隔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞及成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)。Masson染色鏡下觀察，纖維化組肝組織匯管區(qū)、中央靜脈可見(jiàn)大量膠原，肝小葉被大量膠原纖維束分割并包繞，形成纖維間隔(圖1)，提示肝纖維化成功建立。

2.2 纖維化小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上升

與對(duì)照組小鼠比較，可以看到纖維化時(shí)肝中浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 CD25+Foxp3+/CD4+增加(P＜0.01，表1、圖2)，與此同時(shí)，纖維化肝組織CD4+細(xì)胞中CD25+細(xì)胞的表達(dá)頻率以及CD25+細(xì)胞中Foxp3+細(xì)胞的表達(dá)頻率均上升(P＜0.05)。在外周血中，檢測(cè)結(jié)果與肝組織的檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)相同，但與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.3 纖維化時(shí)肝內(nèi)NK1.1+細(xì)胞下降

NK1.1+細(xì)胞在對(duì)照組肝臟中的表達(dá)為(19.80±5.97)%遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在血液中的表達(dá)(1.06±0.63)%(P ＜0.01，n=5)，肝纖維化小鼠肝組織中 NK1.1+細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比為(9.53±2.25)%，顯著低于對(duì)照組(P＜0.05，n=5)，肝纖維化小鼠血液中NK1.1+細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比為(0.38±0.13)%，低于對(duì)照組的表達(dá)(P ＜0.05，n=5)，詳見(jiàn)圖3。

2.4 肝纖維化時(shí)CD4+細(xì)胞、CD4+/CD8+比值下降

肝纖維化時(shí)機(jī)體處于免疫耐受的狀態(tài)，結(jié)果均顯示肝纖維化組肝組織中CD4+細(xì)胞的比例下降，CD4+/CD8+比值下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，血液中亦如此，詳見(jiàn)表2。

圖1 實(shí)驗(yàn)小鼠6周時(shí)肝組織病理學(xué)改變Fig.1 Pathological changes of liver of C57BL/6J mice in the sixth weeks(100×)Black arrow:collagenous fiber bundle.

表1 肝臟內(nèi)和外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化Tab.1 Changes of Tregs frequency in liver and peripheral blood n=3(%)

3 討論

目前采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)肝纖維化的研究主要集中于對(duì)血液細(xì)胞的分析，也有對(duì)脾臟中細(xì)胞變化進(jìn)行研究的。但是這些細(xì)胞都不能很好的說(shuō)明肝臟局部免疫細(xì)胞的變化，因此本研究建立了肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，分析肝臟局部的免疫應(yīng)答狀態(tài)。

Kvakan等［3］研究證實(shí)Tregs細(xì)胞對(duì)心臟纖維化過(guò)程具有抑制作用，Claassen等［4］研究發(fā)現(xiàn)Tregs對(duì)HCV感染導(dǎo)致的肝纖維化可能具有抑制作用。基于Tregs細(xì)胞在器官纖維化中的作用，本研究進(jìn)一步研究其與小鼠肝纖維化的相關(guān)性。結(jié)果顯示，肝纖維化時(shí)，肝臟中浸潤(rùn)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例上升，提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與了CCl4介導(dǎo)的小鼠肝纖維化過(guò)程中的免疫調(diào)節(jié)，也就意味著纖維化時(shí)肝組織局部處于免疫耐受狀態(tài)，筆者在肝纖維化Balb/c小鼠的肝組織中也發(fā)現(xiàn)了相同的情況，并且這種上升不僅表現(xiàn)為CD25+Foxp3+/CD4+的升高，而且CD25+細(xì)胞中Foxp3+的表達(dá)也升高;血中Tregs占淋巴細(xì)胞的比例也有輕微的上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此筆者推測(cè)肝局部浸潤(rùn)Tregs可能對(duì)肝纖維化起到一定的抑制作用。

圖2 肝纖維化組肝臟內(nèi)浸潤(rùn)的Tregs上升Fig.2 The intrahepatic infiltrating Tregs increased in fibrosis group

圖3 外周血和肝臟內(nèi)浸潤(rùn)的NK1.1+細(xì)胞的比較Fig.3 Comparisons of NK1.1+cells in peripheral blood and liver

結(jié)果還顯示纖維化小鼠肝組織和血中的Tregs上升的同時(shí)，CD4+、CD4+/CD8+細(xì)胞呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于例數(shù)過(guò)少。先前很多的文獻(xiàn)［4］報(bào)道CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞可以抑制CD4+、CD8+細(xì)胞的活化和增生，并且這種抑制作用是非特異的，因此推測(cè)肝纖維化時(shí) CD4+、CD4+/CD8+T細(xì)胞比值的下降可能是由Tregs介導(dǎo)的。

目前已證實(shí)NK1.1是小鼠自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)、NKT細(xì)胞特異性分子標(biāo)志，本研究的流式結(jié)果顯示NK1.1+細(xì)胞在小鼠肝組織中的表達(dá)顯著高于其在血液中的表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)［4，6］報(bào)道，與其他器官相比較，小鼠肝內(nèi)的NKT細(xì)胞比例是最高的。筆者還發(fā)現(xiàn)肝纖維化時(shí)，伴隨肝組織Tregs升高的同時(shí)，NK1.1+細(xì)胞下降。Hong 等［7］認(rèn)為體外 Tregs可以直接抑制NKT細(xì)胞的功能，消除小鼠體內(nèi)的Tregs可以增強(qiáng)NKT細(xì)胞的抗腫瘤活性;另外，Tregs對(duì)NK細(xì)胞具有抑制作用［8］，其抑制作用包括降低NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和下調(diào)NK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力［9］。

表2 肝臟中和外周血中CD4+細(xì)胞與CD4+/CD8+比值的比較Tab.2 Comparisons of CD4+cells and ratios of CD4+cells to CD8+cells in peripheral blood and liver %

綜上所述，本研究認(rèn)為肝纖維化時(shí)機(jī)體處于免疫耐受狀態(tài)，表現(xiàn)為T(mén)regs的升高，且肝臟局部的升高更明顯，NK1.1+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞比例下降，并且這些細(xì)胞的下降可能受Tregs的調(diào)節(jié)。

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