雷帕霉素對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓及肺血管重構(gòu)的影響

劉 杰 杜雨軒 王 望 國 桓 王 軍* 王 辰

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，北京100069;2.北京市呼吸和肺循環(huán)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100020;3.衛(wèi)生部北京醫(yī)院，北京100730)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是由不同病因所導(dǎo)致的，以肺動脈壓力和肺血管阻力進(jìn)行性升高為特點(diǎn)的，以肺血管重構(gòu)為主要病理特征的一組綜合征［1］。目前針對肺動脈高壓的治療以舒張血管為主，從而起到緩解癥狀，改善運(yùn)動耐量的作用，但這些藥物并不能從根本上有效的抑制或者逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)［2］，進(jìn)而阻止肺動脈高壓的發(fā)生與發(fā)展。

雷帕霉素(rapamycin)是一種具有抗腫瘤細(xì)胞增生、抗免疫作用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素［3］。它通過與細(xì)胞內(nèi)的FK506結(jié)合蛋白12(FK506-binding protein 12，F(xiàn)KBP12)結(jié)合并形成復(fù)合物后，進(jìn)而與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)相互作用，抑制DNA和蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致G1期細(xì)胞周期阻滯，從而抑制細(xì)胞的增生［4-5］。

因此，本文的目的在于探討雷帕霉素是否可以通過抑制肺血管壁細(xì)胞異常增生從而干預(yù)肺動脈高壓的發(fā)生與發(fā)展，進(jìn)而為肺動脈高壓的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)與思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1)實(shí)驗(yàn)動物及分組:雄性健康成年SD大鼠28只，購自首都醫(yī)科大學(xué)〔實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SCXK(京)2006-0009〕，體質(zhì)量300 g左右，采用抽簽法將動物隨機(jī)分為3組(對照組、野百合堿組和雷帕霉素干預(yù)組)，每組又分為3個時間點(diǎn)，即0周(n=4，由于0周時各組尚未做任何處理，因此3組共用一組實(shí)驗(yàn)動物)，2周(n=4/組)和4周(n=4/組)。① 對照組(control組)(n=4:實(shí)驗(yàn)開始第1天腹腔注射0.9%氯化鈉注射液1次;②野百合堿組(monocrotaline組，MCT組)(n=12):實(shí)驗(yàn)開始第1天腹腔注射MCT(60 mg/kg)1次;③雷帕霉素干預(yù)組(rapamycin組)(n=12):于MCT腹腔注射前1 d給予rapamycin(2 mg/kg)腹腔注射，隨后隔天注射，3 次/周。

2)主要試劑配制及系統(tǒng):MCT購自美國Sigma公司(將MCT溶于1 mol/L HCl后，用1 mol/L NaOH調(diào)整pH為7.4，用0.9%氯化鈉注射液調(diào)整其終濃度為10 g/L)，雷帕霉素購自華北制藥集團(tuán)(用無水乙醇將雷帕霉素配制成濃度為30 g/L的儲液，用含0.25%聚乙二醇400(PEG-400)和0.25%吐溫20(Tween-20)的溶液將儲液稀釋為0.6 g/L的工作液)。PEG-400購于北京化學(xué)試劑公司，Tween-20購于鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1)右心室收縮壓及右心室肥厚指數(shù)的檢測:分別在實(shí)驗(yàn)的0、2、4周將各實(shí)驗(yàn)組動物用2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉，并用250 U的肝素抗凝后，行右心導(dǎo)管插入術(shù)檢測右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)。分離出大鼠心臟，剪掉心耳，沿室間隔剪下右心室，分別稱量右心室(right ventricle，RV)、左心室+室間隔(left ventricle plus interventricular septum，LV+S)的質(zhì)量，計(jì)算 RV/(LV+S)×100%，即右心室肥厚指數(shù)(the index of right ventricular hypertrophy，RVHI)。

2)肺組織病理切片:將各實(shí)驗(yàn)組動物的肺組織固定于4%中性甲醛，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，做4 μm/張的連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色。應(yīng)用Image-Pro Plus 5.1病理圖像分析系統(tǒng)測定各實(shí)驗(yàn)組動物肺小動脈管壁的血管外周長(中膜以內(nèi))和血管腔周長(內(nèi)膜表面以內(nèi))。依據(jù)公式:①中膜厚度=血管外周長/2π－血管腔周長/2π;② 血管壁中層橫截面積=血管外周長2/4π－血管腔周長2/4π;③血管壁中層厚度占外徑百分比(media thickness%，MT%)=(中膜厚度×2)/(血管外周長/π)×100%;④血管壁中層橫截面積占血管總橫截面積百分比(media cross-sectional area%，MA%)=血管壁中層橫截面積/(血管外周長2/4π)×100%。本實(shí)驗(yàn)主要研究外徑在150 μm以下的肺細(xì)小動脈，每只大鼠檢測5～10根血管，每組檢測3只大鼠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 11.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(ˉx±SE)表示，采用3×3析因方差分析，組間均數(shù)比較采用LSD。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況及體質(zhì)量變化

對照組大鼠毛發(fā)光亮，體質(zhì)量隨時間增加。MCT組大鼠毛發(fā)灰暗，活動度降低，體質(zhì)量明顯減輕，胸腔積液，肝臟淤血，肺臟瘀斑，心臟增大。雷帕霉素干預(yù)組體質(zhì)量顯著降低，未見其他異常。與對照組相比，野百合堿組大鼠2周時體質(zhì)量即出現(xiàn)明顯降低〔(369.75 ±2.14)g vs(393.55 ±10.09)g，P ＜0.05〕，4 周時降低更加顯著〔(377.78 ±15.49)g vs(452.33±9.52)g，P ＜0.01〕。雷帕霉素干預(yù)組與野百合堿組相比，體質(zhì)量進(jìn)一步降低，2周時為〔(282.70±6.61)g vs(369.75 ±2.14)g，P ＜0.01〕，4 周時為〔(311.20±3.80)g vs(377.78 ±15.49)g，P ＜0.01〕(圖 1)。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量Fig.1 Comparison of body weight among the groups

2.2 大鼠RVSP的改變及雷帕霉素的干預(yù)作用

對照組大鼠的RVSP在實(shí)驗(yàn)期間無明顯變化。但野百合堿組大鼠自2周起RVSP即明顯高出對照組(47.62 ±15.04)%，至4 周時已經(jīng)高達(dá)(45.40 ±3.53)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。雷帕霉素干預(yù)組大鼠的RVSP盡管在各時點(diǎn)仍高于對照組，但與MCT組比較已明顯降低。在2周和4周時分別降低(17.04±3.52)%和(20.88 ±5.00)%。如表1 所示，雷帕霉素干預(yù)顯著地抑制了野百合堿誘導(dǎo)的大鼠RVSP的升高。

表1 各組大鼠右心室收縮壓Tab.1 Comparison of RVSP among the three groups(ˉx±SE，mm Hg)

2.3 大鼠RVHI的改變及雷帕霉素的干預(yù)作用

對照組大鼠的RVHI在各時點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意思。但MCT組大鼠自2周起RVHI即顯著地高出對照組(16.69±2.48)%，4周時 RVHI繼續(xù)增加達(dá)(55.96±1.96)%。雷帕霉素干預(yù)組大鼠盡管在4周時的RVHI仍高于對照組，但與野百合堿組相比，RVHI顯著降低。2周時雷帕霉素干預(yù)組大鼠RVHI較野百合堿組降低(13.70±4.72)%，4周時降低(36.69±2.62)%。雷帕霉素顯著地抑制了野百合堿誘導(dǎo)的大鼠RVHI的增加，詳見表2。

表2 各組大鼠右心室肥厚指數(shù)Tab.2 Comparison of RVHI among the three groups(ˉx±SE，%)

2.4 大鼠肺血管重構(gòu)及雷帕霉素的干預(yù)作用

對照組大鼠肺腺泡內(nèi)肺動脈管壁較薄，管腔正常。與對照組相比，野百合堿組大鼠肺腺泡內(nèi)肺動脈管壁增厚程度顯著增加，管腔狹窄，并且隨著時間的延長，病理變化更加明顯。雷帕霉素干預(yù)組大鼠腺泡內(nèi)肺動脈結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)基本正常(圖2)。因肺動脈高壓血管壁重構(gòu)主要發(fā)生在血管中層，因此本研究用血管壁中層厚度占外徑百分比(MT%)，血管壁中層橫截面積占血管總橫截面積百分比(MA%)作為衡量肺血管重構(gòu)的指標(biāo)。與對照組相比，野百合堿組大鼠MT%、MA%都增加(P均＜0.01)。與野百合堿組相比，雷帕霉素干預(yù)組大鼠MT%、MA%都降低(P均＜0.01)。如表3所示，雷帕霉素干預(yù)顯著地抑制了野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺血管的重構(gòu)。

3 討論

本研究采用一次性腹腔注射野百合堿的方式，成功地復(fù)制出肺動脈高壓大鼠模型。與對照組相比，野百合堿組大鼠肺動脈壓力、右心室肥厚程度顯著增加，肺小動脈血管壁明顯增厚，管腔狹窄。與野百合堿組相比，雷帕霉素干預(yù)組大鼠肺動脈壓力、右心室肥厚程度顯著降低，肺小動脈血管壁未見明顯增厚。雷帕霉素的早期使用有效干預(yù)了野百合堿所誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓及肺血管重構(gòu)的形成。

肺動脈高壓是一種以肺血管收縮、血管壁重構(gòu)以及原位血栓形成為病理特點(diǎn)的，許多相關(guān)因子參與［6］的以肺血管壁各層細(xì)胞增生為顯著特征的致命性疾病。根據(jù)肺動脈高壓的病理機(jī)制，臨床上針對肺動脈高壓的治療藥物主要通過3種途徑發(fā)揮作用:內(nèi)皮素途徑、一氧化氮途徑以及前列環(huán)素途徑。然而其5年生存率仍僅為50%［7］。另外，由于受到藥物自身藥代動力學(xué)的影響，這些藥物的使用范圍受到了廣泛的限制［8］。因此，探索一種方便、安全、長效的抑制血管壁細(xì)胞增生的藥物成為當(dāng)今治療肺動脈高壓的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。

圖2 各組大鼠肺組織HE染色Fig.2 Sections of the lungs were stained with HE

表3 各組大鼠MT%、MA%Tab.3 Comparison of MT%，MA%of small pulmonary arteries among the groups(ˉx±SE，n=15～30)

在心血管系統(tǒng)中，雷帕霉素能夠有效的抑制生長因子刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞［9］以及成纖維細(xì)胞［10］的增生，因此雷帕霉素藥物洗脫支架安全有效的防止了冠狀動脈支架放置術(shù)后新生內(nèi)膜形成引起的再狹窄［11］。雷帕霉素亦能有效的抑制生長因子等誘導(dǎo)的mTOR/p70S6K信號通路的活化，從而抑制肺血管壁細(xì)胞的生長與增生［12-14］。同時，雷帕霉素也可能通過抑制庫容性鈣離子內(nèi)流(store operated Ca2+entry，SOCE)，降低細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，從而有效的抑制慢性血栓栓塞性肺動脈高壓患者平滑肌細(xì)胞的增生［12］。雷帕霉素還可通過上調(diào)肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞內(nèi)的血紅素加氧酶，來抑制肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞的增生［15］。另外，雷帕霉素可通過上調(diào)KLF4/p27的蛋白表達(dá)［16］，抑制平滑肌細(xì)胞的增生?？梢?，雷帕霉素可以通過調(diào)節(jié)不同的信號通路，抑制血管壁各層細(xì)胞，尤其是血管壁平滑肌細(xì)胞的增生，但其確切的作用機(jī)制，目前尚不清楚。

本研究尚存在許多不足，首先是只使用了單一劑量的雷帕霉素，并沒有檢測不同劑量的雷帕霉素對于野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠的影響。本研究中，雷帕霉素干預(yù)組大鼠的體質(zhì)量明顯低于對照組以及野百合堿組，這可能與藥物的使用劑量有關(guān)。其次，本實(shí)驗(yàn)也沒有研究雷帕霉素對于野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠的逆轉(zhuǎn)作用。再次，關(guān)于雷帕霉素發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入的研究。

總之，本研究通過在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷帕霉素可有效干預(yù)野百合堿所誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠的血流動力學(xué)、右心室肥厚程度以及肺血管重構(gòu)情況。雷帕霉素有可能通過抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞的增生，從而干預(yù)了肺血管壁的重構(gòu)以及肺動脈高壓的形成，從而為臨床上預(yù)防和治療肺動脈高壓提供了新的靶點(diǎn)與思路。

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