淫羊藿提取物對(duì)酵母朊病毒［PSI+］治愈的影響

李 輝，卜祥龍，竇 爽，郭晏華，張 波，宋有濤*

(1.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

朊病毒是一類(lèi)能引起瘋牛病、綿羊瘙癢癥和人克雅氏病等可傳染性海綿樣腦病的病原體，其致死率可達(dá)100%，迄今為止對(duì)于朊病毒疾病仍缺乏有效的治療藥物［1-2］。近年來(lái)，抗朊病毒藥物篩選是國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。研究者通過(guò)構(gòu)建動(dòng)物模型、動(dòng)物細(xì)胞模型、無(wú)細(xì)胞模型和酵母模型在抗朊病毒候選藥物的篩選方面進(jìn)行了大量研究，獲得了戊聚糖多硫酸酯、剛果紅、四磺酸基酞菁等幾十種具有抗朊病毒作用效果的化合物［3-5］。其中，Bach等［6］的研究結(jié)果顯示，一些天然藥物化學(xué)組成成分如芳香性生物堿啡啶及啡啶衍生物類(lèi)具有明顯的抗朊病毒作用;另外，Rambold等［7］發(fā)現(xiàn)姜黃素和綠茶提取物中的主要多酚類(lèi)物質(zhì)表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG)也具有一定的抗朊病毒效果。這暗示著在天然藥物領(lǐng)域可能存在一些具有抗朊病毒活性的活性物質(zhì)。在我國(guó)的中藥研究領(lǐng)域，研究發(fā)現(xiàn)一些草藥和幾百種藥方具有治療帕金森癥和阿爾茨海默癥的臨床效果［8-9］。這2種病癥都與朊病毒疾病有相似的分子機(jī)制，然而，有關(guān)中藥對(duì)酵母朊病毒影響的研究迄今鮮有報(bào)道。本文利用實(shí)驗(yàn)室改良的ΔERG6酵母朊病毒［PSI+］細(xì)胞模型，選取淫羊藿、千年健、生龍齒、刺五加、竹茹、熟地黃6種對(duì)阿爾茨海默癥有一定療效的菊科中藥材作為研究材料。采取向酵母培養(yǎng)基中直接添加中藥生藥并滅菌處理的方式來(lái)研究中藥對(duì)酵母朊病毒聚集的影響，篩選出具有抗朊病毒作用的藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 ΔERG6釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae:MATα kar1 SUQ5 ade2-1 his3Δ202 leu2Δ1 trp1Δ63 ura3-52 erg6::KanMX，［PSI+］，7796-A菌系。

1.1.2 培養(yǎng)基(w/v，%) ①1/2YPD液體培養(yǎng)基:酵母浸出粉0.5，蛋白胨2，葡萄糖2，pH 自然，注意葡萄糖分裝，在115℃高壓蒸汽滅菌25 min，4℃保存;②1/2YPD固體培養(yǎng)基:酵母浸出粉 0.5，蛋白胨2，葡萄糖 2，瓊脂粉 2，pH 自然，注意葡萄糖分裝，115℃高壓蒸汽滅菌25 min，4℃下保存;③YPAD固體培養(yǎng)基:酵母浸出粉1，蛋白胨2，腺嘌呤0.04，葡萄糖2，瓊脂粉2，pH 自然，注意葡萄糖分裝，115℃高壓蒸汽滅菌25 min，4℃保存;④SD固體培養(yǎng)基:YNB-AA 0.7，葡萄糖2，瓊脂粉2，pH自然，115℃高壓蒸汽滅菌25 min，注意葡萄糖分裝，待冷卻到65℃時(shí)，按實(shí)驗(yàn)需要加入一定量的氨基酸及營(yíng)養(yǎng)成分，其終濃度:Ade:20 mg/L，Ura:20 mg/L，Trp:20 mg/L，Leu:60 mg/L。輕輕搖勻后倒平板。

1.1.3 中藥生藥 淫羊藿、刺五加購(gòu)于沈陽(yáng)市東北大藥房;千年健、生龍齒、竹茹、熟地黃購(gòu)于草到祁州方成藥店。

1.2 方法

1.2.1 含中藥提取液培養(yǎng)基的制備 中藥材經(jīng)過(guò)粉碎后，準(zhǔn)確稱(chēng)量中藥粉末10 g置于圓底燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，在95℃回流提取3 h，抽濾并回收濾液;稱(chēng)量濾液體積，添加1/2YPD液體培養(yǎng)基的各種成分配置成相當(dāng)于含中藥粉末的1/2YPD液體培養(yǎng)基。

1.2.2 淫羊藿醇提物的制備 淫羊藿經(jīng)過(guò)粉碎后，準(zhǔn)確稱(chēng)量中藥粉末30 g置于圓底燒瓶中，加入300 mL 95%乙醇，在95℃回流提取3 h，抽濾并回收濾液;減壓蒸發(fā)濃縮，濃縮液置于潔凈小瓶中，于60℃過(guò)夜干燥，30℃放置至恒重并稱(chēng)量。用盡可能少量的5%DMSO溶解淫羊藿提取物，計(jì)算淫羊藿提取物的濃度為0.650 g/mL。

1.2.3 淫羊藿水提物的制備 淫羊藿經(jīng)過(guò)粉碎后，準(zhǔn)確稱(chēng)量中藥粉末30 g置于圓底燒瓶中，加入300 mL蒸餾水，在95℃回流提取3 h，抽濾并回收濾液;減壓蒸發(fā)濃縮，濃縮液置于潔凈小瓶中，于60℃過(guò)夜干燥，30℃放置至恒重并稱(chēng)量。用盡可能少量的蒸餾水溶解淫羊藿提取物，計(jì)算淫羊藿提取物的濃度為0.425 g/mL。

1.2.4 遺傳表型實(shí)驗(yàn) ［PSI+］酵母細(xì)胞在24℃過(guò)夜活化培養(yǎng)后，調(diào)整菌液OD600至0.2左右，按10%接種量分別接種到含有指定化合物的1/2YPD液體培養(yǎng)體系，所有體系于24℃振蕩培養(yǎng)5 d，在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)間隔24 h更換培養(yǎng)基和化合物［10］。5 d后取培養(yǎng)液稀釋后涂布于1/2YPD固體平板，平板于24℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落顏色變化，統(tǒng)計(jì)不同顏色菌落的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種中草藥對(duì)酵母朊病毒的影響

圖1 6種中草藥抗酵母朊病毒的活性Fig.1 The activity of six kinds of Chinese herbal medicine against yeast prions

本實(shí)驗(yàn)室使用的［PSI+］酵母細(xì)胞ade2-1突變體中，ADE基因的翻譯被人為突變的終止密碼子阻斷，因此［psi-］酵母細(xì)胞在少量Ade培養(yǎng)基(1/2YPD)上形成紅色菌落，在缺乏Ade的選擇性培養(yǎng)基(-Ade SD)上不能生長(zhǎng);而［PSI+］酵母細(xì)胞在1/2YPD上形成白色的菌落，在-Ade SD上可以生長(zhǎng)［11］。利用上述酵母朊病毒細(xì)胞獨(dú)特的遺傳表型，檢測(cè)淫羊藿、千年健、生龍齒、刺五加、竹茹、熟地黃6種中草藥對(duì)朊病毒［PSI+］的治愈效果(圖1)。

結(jié)果顯示，千年健、生龍齒、刺五加、竹茹、熟地黃等5種中藥在1～5 d內(nèi)都沒(méi)有出現(xiàn)紅色菌落，而淫羊藿在5 d時(shí)出現(xiàn)部分紅色菌落，為總菌落數(shù)的1%。從表型上看，淫羊藿作用后的紅色菌落初步被認(rèn)為是治愈的［psi-］，白色菌落為未治愈的［PSI+］。

2.2 定量分析淫羊藿水提物、醇提物對(duì)酵母朊病毒的治愈效果

為了深入研究淫羊藿對(duì)酵母朊病毒的治愈作用，對(duì)淫羊藿進(jìn)行了水提和醇提，然后分別研究了0.032、0.065、0.0975 g/mL 濃度下對(duì)酵母朊病毒治愈的表型分布。如表1所示，0.0975 g/mL的淫羊藿醇提取物作用于［PSI+］細(xì)胞1～3 d后沒(méi)有出現(xiàn)紅色菌落，但作用5 d后出現(xiàn)了紅色菌落，其比例為3%。由于淫羊藿醇提物的濃度大于0.0975 g/mL時(shí)有嚴(yán)重的抑菌作用，因此0.0975 g/mL是治愈的最佳濃度。而淫羊藿水提物并沒(méi)有治愈效果。

表1 淫羊藿醇提物、水提物對(duì)［PSI+］的治愈效果Table 1 Effect of curing［PSI+］by using alcohol extract and water extract of Herba Epimedii

2.3 影印培養(yǎng)法檢測(cè)淫羊藿醇提物對(duì)酵母朊病毒的作用效果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證淫羊藿醇提物的治愈效果，以排除假陽(yáng)性的可能性，本實(shí)驗(yàn)利用影印培養(yǎng)法隨機(jī)選取最佳濃度治愈下紅色菌落，分別影印到Y(jié)PAD、SD-Ade和1/2YPD平板上。由圖2可以看出，被淫羊藿醇提物治愈的酵母細(xì)胞在1/2YPD培養(yǎng)基上為紅色，在YPAD為白色菌落，而在缺乏Ade的SD培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。這說(shuō)明淫羊藿醇提物對(duì)酵母朊病毒［PSI+］的治愈結(jié)果不是由基因突變引起的顏色指示系統(tǒng)變化，是可靠的。

圖2 影印培養(yǎng)法檢測(cè)淫羊藿醇提物作用效果Fig.2 Detect positive results in different mediums

2.4 淫羊藿治愈后酵母［psi-］表型的傳代穩(wěn)定性

酵母朊病毒［PSI+］經(jīng)淫羊藿治愈后形成的［psi-］表型在1/2YPD平板上生長(zhǎng)為紅色菌落，其脫離藥物作用后可能會(huì)出現(xiàn)一些不穩(wěn)定的表型，研究淫羊藿醇提物最佳治愈濃度作用5 d后出現(xiàn)的紅色(R)菌落的傳代穩(wěn)定性。如圖3所示，紅色菌落傳代36代后表型仍然穩(wěn)定。這說(shuō)明淫羊藿對(duì)酵母朊病毒［PSI+］的治愈是不可逆的。

圖3 分析治愈后菌落表型的傳代穩(wěn)定性Fig.3 Generation stability of colony phenotype

3 討論

利用ΔERG6酵母朊病毒［PSI+］細(xì)胞模型，從淫羊藿、千年健、生龍齒、刺五加、竹茹、熟地黃6種對(duì)阿爾茨海默癥有一定療效的菊科中草藥中篩選出具有抗酵母朊病毒作用的淫羊藿，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)只有淫羊藿醇提物對(duì)酵母朊病毒具治愈作用。定量分析顯示，淫羊藿醇提物的最佳治愈濃度為0.0975 g/mL，治愈率可達(dá)到3%。

據(jù)《中國(guó)藥典》記載，淫羊藿性味辛、甘、溫，歸肝、腎經(jīng)，具有溫心陽(yáng)、通心脈、化淤血等功效［12］。淫羊藿的主要成分是淫羊藿苷類(lèi)、生物堿、黃酮類(lèi)等，此類(lèi)成分易溶于水、甲醇、乙醇等溶媒。結(jié)合此前發(fā)現(xiàn)的啡啶等芳香性生物堿的抗朊病毒作用，推測(cè)淫羊藿中的抗朊病毒的活性物質(zhì)為生物堿類(lèi)，但這需要下一步更精細(xì)的分離純化研究的驗(yàn)證。

近20年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)在酵母中至少存在8種安全無(wú)害的朊病毒［PSI+］、［URE3］、［PIN+］、［NU+］、［SWI+］、［OCT+］、［MOT3+］和［NSI+］，而且還發(fā)現(xiàn)了在釀酒酵母(S.cerevisiae)中存在19種具有朊病毒性質(zhì)的蛋白。對(duì)比哺乳動(dòng)物朊病毒，酵母朊病毒具有很多優(yōu)點(diǎn)，因而在朊病毒的發(fā)生機(jī)理和抗朊病毒藥物的篩選研究上倍受重視?；?Wickner等發(fā)現(xiàn)酵母攜帶［PSI+］、［URE3］等與動(dòng)物朊病毒聚集、傳播機(jī)制相似的朊病毒，這些朊病毒具有各自的表型特征，Lindguist等進(jìn)一步驗(yàn)證了酵母朊病毒對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞及個(gè)體的安全性，并發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞具有與哺乳類(lèi)細(xì)胞相似的朊病毒形成的胞內(nèi)環(huán)境。2003年Blondel等利用野生型酵母朊病毒［PSI+］、［URE3］細(xì)胞為模型，在2500多種化學(xué)藥物中篩出了6種抗酵母朊病毒聚集的化合物，并證明這些化合物在動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)于動(dòng)物朊病毒同樣有抗聚集作用。而且還證實(shí)了部分對(duì)哺乳動(dòng)物朊病毒有效的朊病毒同樣對(duì)酵母朊病毒具有一定的治愈效果。

朊粒的發(fā)現(xiàn)是繼艾滋病病毒之后對(duì)人類(lèi)提出的又一巨大挑戰(zhàn)。目前，人們對(duì)這類(lèi)傳染性中樞神經(jīng)機(jī)能退化癥還缺乏有效的診斷和治療手段。因此，朊粒病的預(yù)防顯得尤為重要。可按傳染病的要求進(jìn)行預(yù)防:①消滅已知感染的哺乳動(dòng)物 ，對(duì)人進(jìn)行適當(dāng)?shù)母綦x;②禁止食用可能污染的食物，對(duì)神經(jīng)外科的操作器械進(jìn)行嚴(yán)格處理，對(duì)器官移植要排除患朊粒病的可能;③對(duì)家族性疾病的家屬應(yīng)注意防止接觸［13］。

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