喉癌組織中的microRNA差異表達(dá)譜及miR-125a-5p抑制喉癌細(xì)胞增殖的初步研究*

張思毅， 盧仲明， 宋新漢， 張鴻彬， 陳良嗣， 羅小寧， 陳少華， 吳一龍

( 1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515; 2廣東省人民醫(yī)院,廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科, 3廣東省肺癌研究所，廣東 廣州 510080)

喉癌組織中的microRNA差異表達(dá)譜及miR-125a-5p抑制喉癌細(xì)胞增殖的初步研究*

張思毅1,2△， 盧仲明1,2， 宋新漢2， 張鴻彬2， 陳良嗣2， 羅小寧2， 陳少華2， 吳一龍3△

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515;2廣東省人民醫(yī)院,廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科,3廣東省肺癌研究所，廣東 廣州 510080)

目的篩選并分析喉癌組織與周圍正常喉黏膜的微小RNA(microRNAs，miRNAs) 之間的表達(dá)譜差異，為進(jìn)一步研究miRNA與喉癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供線索。方法收集喉癌組織和癌旁正常喉黏膜標(biāo)本共42對(duì)，隨機(jī)選取10對(duì)標(biāo)本進(jìn)行miRNA微陣列基因芯片分析, 另選取32對(duì)標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)驗(yàn)證，獲得喉癌組織中的miRNA差異表達(dá)譜。應(yīng)用MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測miR-125a-5p對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果喉癌組織中的let-7f-5p、miR-10a-5p、miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-195-5p、miR-203等6個(gè)miRNA在基因芯片以及qRT-PCR中表達(dá)均顯著下調(diào)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-125a-mimics組的喉癌Hep2細(xì)胞增殖能力受到抑制，而轉(zhuǎn)染miR-125a-inhibitor組Hep2細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。結(jié)論基因芯片與qRT-PCR結(jié)果一致；喉癌與正常喉黏膜之間存在明顯的miRNA差異表達(dá)，這些miRNA的差異性表達(dá)可能與喉癌的發(fā)病、侵襲等相關(guān)。miR-125a可以抑制喉癌Hep2細(xì)胞的增殖，可能作為喉癌生物治療的新靶點(diǎn)。

喉腫瘤； 微小RNA； 微陣列芯片； 細(xì)胞增殖

頭頸腫瘤是危及人類生命的主要癌癥之一，在所有癌癥中發(fā)病率居第6位。喉癌是最常見的頭頸腫瘤之一，在呼吸道腫瘤中發(fā)病率居第2位，絕大多數(shù)為鱗狀細(xì)胞癌。有國內(nèi)外調(diào)查表明，喉癌的發(fā)病率不斷升高，每年約增加25%[1-2]，2008年世界上男性喉癌發(fā)病率估計(jì)為5.1/100 000，男性病人死亡率約為2.2/100 000。根據(jù)最新的研究，雖然近30年來新的外科手術(shù)方法、化療藥物及更先進(jìn)的放射治療手段已應(yīng)用在喉癌的治療中，與其它頭頸癌一樣，喉癌患者的總生存率并未得到提高，甚至有所下降[3]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)喉癌的可能病因包括吸煙、酗酒、空氣污染、職業(yè)因素等[4-5]等。盡管有研究表明，喉癌的發(fā)生發(fā)展與某些癌基因(如bcl-2、c-myc等)和抑癌基因(如p53、Rb、p16、p21等)相關(guān)，但喉癌的分子水平發(fā)病機(jī)制目前仍未明確，因此目前還難以從分子機(jī)制干預(yù)喉癌的發(fā)病并提高其生存率。

微小RNAs (microRNAs, miRNAs)是一類長度大約19～25 nt小分子非編碼RNA。它主要通過與靶基因3’非翻譯區(qū)(3’ untranslated region ,3’UTR)的完全或不完全配對(duì)，降解靶基因mRNA 或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，從而參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動(dòng)[6-7]。近年研究提示， miRNAs 可能作為癌基因或抑癌基因在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成的基因調(diào)控中扮演了重要角色[8-9]，并可能與喉癌等頭頸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[10]，提示miRNA可能作為喉癌的生物標(biāo)記物或治療靶標(biāo)在喉癌的早期診斷、治療、預(yù)后等方面具有潛在的臨床價(jià)值。

然而，迄今為止，對(duì)喉癌中miRNA的差異表達(dá)情況尚未完全闡明。本研究采用涵蓋了miRbase數(shù)據(jù)庫中全部人類microRNA的第6代miRCURYTMLNA微陣列芯片，對(duì)喉癌中的miRNA差異表達(dá)進(jìn)行初步篩選，通過實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，并初步地研究了miR-125a-5p(原名miR-125a)對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞增殖的影響。旨在為進(jìn)一步研究miRNA與喉癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供線索，以便更好地了解喉癌分子水平的發(fā)病機(jī)制。

材 料 和 方 法

1組織標(biāo)本采集與臨床資料的收集

收集2007年10月～2009年3月廣東省人民醫(yī)院手術(shù)切除的喉癌組織及癌旁正常組織共42對(duì)：術(shù)中分別切取經(jīng)病理證實(shí)的喉癌組織及距離手術(shù)陰性切緣至少2 cm的正常喉黏膜各約0.5 cm3，標(biāo)本經(jīng)適量生理鹽水漂洗后迅速存入RNA later液(Qiagen公司)中保存，并于-80℃ 冰箱中保存。42例喉癌患者的臨床病理資料見表1，所有患者術(shù)后病理診斷均為鱗狀細(xì)胞癌，術(shù)前均未接受放、化療。將其隨機(jī)分為2組：10對(duì)喉癌標(biāo)本進(jìn)行microRNA芯片檢測，另32對(duì)標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)驗(yàn)證。

表1喉癌病人臨床病理資料

Table 1. Clinicopathological characteristics of the laryngeal carcinoma patients (n=42)

ItemDataAge(year.Mean±SD)59.8±11.7Sex[n(%)] Male39(92.9) Female3(7.1)Type[n(%)] Supraglottic12(28.6) Glottic28(66.7) Subglottic2(4.8)Clinicalstage[n(%)] I19(45.2) II8(19.0) III2(4.8) IV13(31.0)Tstage[n(%)] T119(45.2) T210(23.8) T35(11.9) T48(19.1)Nstage[n(%)] N033(78.6) N1～39(21.4)Differentiation[n(%)] Poorlydifferentiated3(7.1) Moderatelydifferentiated23(54.8) Highlydifferentiated16(38.1)

2總RNA抽提及驗(yàn)證

應(yīng)用Invitrogen公司的Trizol和Qiagen公司的miRNeasy mini kit試劑盒抽提總RNA，按照說明書操作，覆蓋了各種RNA，包括miRNAs。使用Nanodrop公司的分光光度計(jì)ND-1000測定RNA的質(zhì)量和定量，RNA的完整性由凝膠電泳判定。

3MicroRNA基因芯片檢測分析

隨機(jī)選取10對(duì)喉癌標(biāo)本的總RNA進(jìn)行以下microRNA芯片檢測。

3.1對(duì)RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記和芯片雜交 抽提RNA后，使用丹麥Exiqon公司的miRCURYTMHy3TM/Hy5TMPower labeling kit，按說明書進(jìn)行miRNA標(biāo)記。在熒光標(biāo)記后，Hy3TM標(biāo)記的樣品按手冊(cè)在miRCURYTMLNA 16.0 (Exiqon)芯片進(jìn)行雜交。

3.2清洗掃描及信號(hào)數(shù)字化處理 MicroRNA芯片雜交后，用洗脫緩沖液(Exiqon)洗數(shù)次后400 r/min離心5 min干燥。用Axon GenePix 4000B microarray scanner (Axon)進(jìn)行掃描。

掃描得到的圖像輸入GenePix Pro 6.0(Axon)軟件進(jìn)行坐標(biāo)調(diào)整和數(shù)據(jù)提取。重復(fù)的miRNAs數(shù)據(jù)取均數(shù)，選出在所有樣品中強(qiáng)度均≥50 的miRNAs計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化因子。表達(dá)數(shù)據(jù)使用中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，顯著差異表達(dá)的miRNAs通過火山圖(Volcano Plot)過濾后確認(rèn)。使用MEV 4.6軟件(TIGR) 進(jìn)行聚類分析。

4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證

另取32對(duì)喉癌組織及癌旁正常黏膜組織標(biāo)本，提取總RNA。采用SYBR Green染料法，以U6為內(nèi)參照，對(duì)微陣列芯片結(jié)果中的6個(gè)miRNA: let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、miRNA-195-5p和miRNA-203在各樣品中的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。

4.1逆轉(zhuǎn)錄 32對(duì)組織抽提總RNA后，取2 ng～2 μg總RNA用MMLV-RT逆轉(zhuǎn)錄酶按照說明合成cDNA：在總RNA中加入所有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RT引物(廣州銳博生物公司合成)，用無RNA酶水補(bǔ)足至24 μL，混勻，70 ℃溫育10 min后冰浴2 min。依次加入RNA酶抑制劑2 μL、5×M-MLV Buffer 8 μL、RTase M-MLV(RNase H-)2 μL，dNTP Mixture 2 μL ，用無RNA酶水補(bǔ)足至40 μL， 30 ℃反應(yīng)10 min，再42 ℃孵育1 h，最后70 ℃保溫15 min，獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR模板。

4.2定量PCR 反應(yīng)在Bio-Rad的熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增, 每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)體系為20 μL總體系：2× Mix SYBR Green I熒光反應(yīng)液10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.25 μL，樣品模板1 μL，用無RNA酶水補(bǔ)足20 μL體系。反應(yīng)條件為: 95 ℃ 預(yù)變性20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s,70 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)，繪制擴(kuò)增曲線；40個(gè)循環(huán)后對(duì)60 ℃到95 ℃升溫整個(gè)過程進(jìn)行全程熒光信號(hào)收集，繪制熔解曲線。反應(yīng)結(jié)束得到各反應(yīng)管循環(huán)閾值(threshold cycle, Ct)。對(duì)獲得的Ct值采用2-ΔΔCt法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。

5細(xì)胞培養(yǎng)

5.1細(xì)胞株、培養(yǎng)基及相關(guān)試劑、儀器 喉癌Hep2細(xì)胞(購自ATCC收藏中心)；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco)；RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Gibco)；0.25%胰蛋白酶(Gibco)；37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)。 3-(4，5)-雙甲基-2-噻唑-(2，5)-二甲苯基溴化四氮唑(MTT;Sigma)，5 g/L；二甲亞砜(DMSO;Sigma)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，96孔板和6孔板(康寧)，蘇木素(上海宏基)，脫色搖床(Qilinbeier)。

5.2細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h消化和計(jì)數(shù)細(xì)胞，在6孔板的每孔中接種4×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到70%～80%匯合進(jìn)行轉(zhuǎn)染；將Hep2細(xì)胞分別與miR-125a-mimic、miR-125a-inhibitor和陰性對(duì)照混合，置于250 μL無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基Opti-MEM中，加入4 μL FuGENE?6 Transfection Reagent，混勻，室溫放置15 min；吸棄細(xì)胞培養(yǎng)物中的完全培養(yǎng)基，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基Opti-MEM漂洗細(xì)胞2次，加入無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基Opti-MEM 1.5 mL；將DNA-FuGENE?6 Transfection Reagent復(fù)合物加入細(xì)胞中，前后輕晃6孔板使混合液分散均勻。6 h后吸棄轉(zhuǎn)染復(fù)合物，換入含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基。

5.3MTT實(shí)驗(yàn) 用胰蛋白酶消化匯合的單層細(xì)胞，將細(xì)胞收集到含血清的培養(yǎng)基中。離心細(xì)胞懸液，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。將細(xì)胞稀釋至(0.5～1)×107/L，每個(gè)孔加入200 μL細(xì)胞懸液，每種細(xì)胞分4份分別種于4個(gè)96孔板，每份細(xì)胞3復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第1、3、5、7 d時(shí)，分別取出1個(gè)96孔板進(jìn)行檢測。每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，37 ℃濕潤環(huán)境中溫育4 h。棄去孔中的培養(yǎng)基和MTT，加入150 μL DMSO，水平搖床低速混合10 min。酶標(biāo)儀490 nm處記錄吸光度(A)。將1、3、5、7 d測得的A值匯總，繪制各組細(xì)胞的生長曲線。

5.4克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度5×105cells/L，分于6孔板，每孔2 mL，即1 000 cells/well。培養(yǎng)7～10 d，觀察克隆出現(xiàn)日期及生長情況，大于50個(gè)細(xì)胞的集落算1個(gè)克隆。PBS洗3次，加固定液甲醇1 mL/well搖床上放置10 min。加入1 mL/well蘇木素放置搖床上10 min染色，倒掉蘇木素。計(jì)數(shù)每個(gè)孔的克隆數(shù)并拍照，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

MicroRNA基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用芯片顯著性分析軟件(significance analysis of microarrays, SAM)進(jìn)行分析, 設(shè)定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)為0.05，篩選出喉癌組織和癌旁組織之間差異表達(dá)的microRNA。用SPSS 13.0軟件分析，兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1總RNA提取質(zhì)量分析

經(jīng)分光光度計(jì)檢測，所有樣本提取的總RNA的A260/A280均在1.9～2.1之間；瓊脂糖凝膠電泳：28S和18S的RNA呈現(xiàn)明顯、銳利的條帶，而且28S帶熒光強(qiáng)于18S，二者之比約為2∶1。結(jié)果表明樣品總RNA的質(zhì)量可靠、未降解，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2miRNA基因芯片結(jié)果

我們通過miRNA芯片篩選得到了2 662個(gè)差異表達(dá)的miRNA，將其中的非人類miRNA以及超過一半樣本無法檢測到的miRNA去除后，比較了780個(gè)miRNA，采用SAM軟件分析, 設(shè)定FDR為0.05，發(fā)現(xiàn)相對(duì)正常黏膜, 在腫瘤組織中共有11個(gè)miRNA表達(dá)顯著上調(diào)； 114個(gè)miRNA表達(dá)顯著下調(diào)，見圖1、2。

3qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、miRNA-195-5p、miRNA-203等6個(gè)miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，這6個(gè)miRNA在32對(duì)喉癌與周圍正常喉黏膜組織之間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miRNA定量PCR溶解曲線均為單一峰，說明PCR擴(kuò)增特異性好。我們?cè)賹⑿酒Y(jié)果與qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示這6個(gè)miRNA表達(dá)均下調(diào)，miRNA芯片與qRT-PCR的結(jié)果相符,見圖3。

Figure 1. Heatmap of miRNA microarray in laryngeal squamous-cell carcinoma. Hierarchical clustering of differentially expressed miRNAs are shown in paired tumor-normal samples. Tissue samples are represented in columns, and differentially expressed miRNAs are delineated in rows. Red:up-regulation; green: down-regulation.

圖1喉鱗狀細(xì)胞癌miRNA微陣列芯片熱點(diǎn)圖

Figure 2. Significant miRNA genes identified using SAM analysis. From this analysis, there were 11 genes highly expressed and 114 genes lowly expressed in laryngeal cancer.

圖2通過SAM軟件分析獲得的顯著差異的miRNA基因

Figure 3. Comparison of the fold change for qRT-PCR and microarray data for selected miRNAs. Both miRNA microarray and qRT-PCR showed that the expression of let-7f-5p,miR-10a-5p,miR-125a-5p,miR-144-3p,miR-195-5p and miR-203 were down-regulated in laryngeal cancer tissue.

圖3選定的6個(gè)miRNAs的qRT-PCR與微陣列芯片結(jié)果比較

4MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,喉癌Hep2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-125a-mimics、 miR-125a-inhibitor及陰性對(duì)照(NC)后，與NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-125a-5p-mimics組活細(xì)胞數(shù)量顯著降低(第1 d：P<0.05；第3、5、7 d：P<0.01)，Hep2細(xì)胞增殖能力受到抑制；而轉(zhuǎn)染miR-125a-inhibitor活細(xì)胞數(shù)量顯著增加，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(第1 d：P<0.05；第3、5、7 d：P<0.01),見圖4。

5克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-125a-mimics組Hep2細(xì)胞克隆形成率[(7.6± 0.9)%]顯著低于NC組的克隆形成率[(17.5±0.9)%](P<0.01)；而轉(zhuǎn)染miR-125a-inhibitor組的克隆形成率[(21.4±0.8)%]顯著高于NC組的克隆形成率[(10.0± 0.7)%](P<0.01)。這說明miR-125a-5p 表達(dá)對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞的增殖能力有顯著抑制作用,見圖5。

Figure 4. MTT assays. A：up-regulation of miR-125a suppressed cell growth of human epidermoid carcinoma cell line Hep2; B：inhibition of miR-125a promotes cell growth of human epidermoid carcinoma cell line Hep2. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsnegative control (NC).

圖4MTT實(shí)驗(yàn)檢測喉癌Hep2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-125a-mimics和miR-125a-inhibitor后增殖能力的變化

討 論

在本研究中我們總共應(yīng)用了42對(duì)新鮮冰凍喉癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，其中10對(duì)標(biāo)本采用丹麥Exiqon公司的第6代miRCURYTMLNA 16.0芯片進(jìn)行分析，獲得了喉癌及其癌旁正常黏膜組織中miRNA的全基因表達(dá)譜，使用SAM軟件找到與喉癌相關(guān)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的特征性miRNA。并進(jìn)一步對(duì)另外32對(duì)標(biāo)本應(yīng)用莖環(huán)引物的熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、miRNA-195-5p、miRNA-203等6個(gè)miRNA在基因芯片以及qRT-PCR中均顯著下調(diào)。qRT-PCR與芯片結(jié)果一致，說明了本實(shí)驗(yàn)基因芯片結(jié)果的可靠性。本研究還通過MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了miRNA-125a-5p可抑制喉癌Hep2細(xì)胞增殖，其可能成為喉癌生物治療的新靶點(diǎn)。

Figure 5. Colony-forming assay (crystal violet staining).A：Hep2 cells were transiently transfected with miR-125-mimics or scrambled sequence oligonucleotide as negative control (NC). Colony-forming assay showed a decrease in cell colony numbers relative to NC.B：Hep2 cells transfected with miR-125-inhibitor showed an increase in cell colony numbers relative to NC.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC.

圖5克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測miR-125a-5p表達(dá)對(duì)喉癌細(xì)胞Hep2增殖能力的影響

微陣列芯片技術(shù)是研究miRNA表達(dá)譜的重要手段。目前已發(fā)現(xiàn)的人類miRNAs有近2 000種(http://www.mirbase.org)，對(duì)數(shù)量如此龐大的miRNAs進(jìn)行分析研究，需要高效率、高通量的檢測技術(shù)。miRNA微陣列芯片技術(shù)與傳統(tǒng)RNA分析方法比較，具有明顯優(yōu)勢: (1)高通量，可以同時(shí)檢測上千個(gè)miRNA； (2)靈敏度和效率高； (3)樣本需要量小:僅需1 μg總RNA即可完成所有檢測。我們的研究應(yīng)用了具有高靈敏度和特異性、最新版本的含有1 890個(gè)miRNA探針、可檢測目前miRbase數(shù)據(jù)庫中全部microRNA的miRCURYTMLNA 16.0 microRNA微陣列芯片進(jìn)行檢測，盡可能地保證了結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

qRT-PCR 被廣泛認(rèn)為是包括miRNA在內(nèi)的核酸定量檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[11]。由于目前miRNA微陣列芯片結(jié)果仍存在一定的假陽性，經(jīng)其篩選所得的差異表達(dá)的miRNA一般仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。目前最常用于驗(yàn)證在微陣列基因芯片等高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的特異性miRNA。 Chen等[12]發(fā)明的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的實(shí)時(shí)定量PCR(stem-loop RT-PCR)因具有簡便、高敏感、高特異等特點(diǎn)已成為目前miRNA定量檢測法的推薦的qRT-PCR方法。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果一般應(yīng)用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算miRNA的表達(dá)水平[13]。

目前miRNA在喉癌表達(dá)譜的研究仍存在諸多不足之處：多為頭頸鱗癌的研究，單純喉癌研究很少。雖然頭頸部各種腫瘤的發(fā)病部位相近，然而，喉部作為呼吸系統(tǒng)的一部分，與口腔、咽部等所屬的消化系統(tǒng)有所不同[14- 15]。喉癌與口腔癌、口咽癌、下咽癌等頭頸鱗癌有著不同的臨床病理特征及預(yù)后，例如喉癌病人的性別構(gòu)成中男性發(fā)病比例明顯較其它頭頸腫瘤高[15]。而且，有喉癌與其它頭頸鱗癌的基因組雜交比較研究發(fā)現(xiàn)，兩者的染色體型存在明顯差異[16]。所以，不區(qū)分部位地對(duì)頭頸鱗癌一起進(jìn)行研究可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性并帶來偏倚。此外，現(xiàn)有多數(shù)研究的標(biāo)本量較?。徊煌芯拷Y(jié)果間存在差異；一些研究使用石蠟包埋組織(在固定和包埋過程中可降解或者發(fā)生嚴(yán)重的交聯(lián),故結(jié)果可能不如新鮮冰凍組織準(zhǔn)確)；不少研究僅進(jìn)行基因芯片檢測，未進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證等均可能對(duì)研究結(jié)果帶來一定影響。

在我們的喉癌miRNA差異表達(dá)譜研究結(jié)果中，有miRNA-10a-5p[17]、miRNA-125a-5p[10]、miRNA-203[18]、miRNA-144-3p[19]等 microRNA與以往的頭頸鱗癌的文獻(xiàn)報(bào)道一致。其中miRNA-125a-5p[10]、miRNA-203[18]和miRNA-144-3p 3個(gè)miRNA在文獻(xiàn)中僅進(jìn)行基因芯片檢測的miRNA，我們對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證,而且在細(xì)胞水平初步研究了miRNA-125a-5p對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞的增殖的影響。

同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)了一些尚未在頭頸鱗癌或喉癌研究中報(bào)道的或結(jié)果不一致的microRNA，如let-7f-5p、miR-195-5p。Let-7是最早在秀麗隱桿線蟲(C. elegans)中發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，包括多個(gè)家族成員，如let-7a、b、c、d、e、f。有研究認(rèn)為let-7i在頭頸鱗癌中高表達(dá)[10]，而let-7a、c、e低表達(dá)[17]。在我們的研究中喉癌組織的Let-7f-5p呈低表達(dá)，與Tran等[20]的研究(Let-7f-5p為高表達(dá))相反，這可能是因?yàn)門ran的研究是對(duì)舌、扁桃體、下咽、喉等多種頭頸腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行芯片檢測，而且沒有對(duì)Let-7f進(jìn)行驗(yàn)證；而我們的研究則選用新鮮冰凍喉癌組織進(jìn)行研究，而且進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證。這也進(jìn)一步證明了對(duì)喉癌等單病種而非多部位的不同頭頸腫瘤合并研究的優(yōu)勢。miR-195是microRNA-15/16/195/424/497家族的重要成員，在肝癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病等多種腫瘤中均存在異常的表達(dá)下調(diào)[21]，提示miR-195可能是一個(gè)重要的腫瘤抑制因子。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，在喉癌中miR-195可能同樣存在異常的低表達(dá)，但仍需要細(xì)胞水平的研究以進(jìn)一步證實(shí)。

本研究首次通過基因芯片和qRT-PCR技術(shù)證實(shí)了miRNA-125a-5p在喉癌組織中表達(dá)下調(diào)，并在細(xì)胞水平初步研究了miRNA-125a-5p對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞的增殖的影響, 轉(zhuǎn)染miR-125a-mimics組細(xì)胞增殖能力受到抑制，而miR-125a-inhibitor促進(jìn)其增殖能力。張帥等[22]研究表明，miRNA-125等miRNAs可能通過調(diào)控一些癌基因和抑癌基因(bcl-2、p53等)參與了去甲斑蝥素促進(jìn)慢性髓細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞凋亡的過程。還有研究顯示，miR-125a在肝癌組織和細(xì)胞株中均表達(dá)下調(diào)，并與侵襲性的病理學(xué)特征相關(guān)，上調(diào)miR-125a可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶11和血管內(nèi)皮生長因子顯著抑制肝癌細(xì)胞的惡性表型[23]，提示了其成為腫瘤的有效治療手段和預(yù)后標(biāo)志物的潛力。

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DifferentialmicroRNAexpressionprofileinlaryngealcancerandeffectofmiR-125a-5ponproliferationoflaryngealcancercellline

ZHANG Si-yi1,2, LU Zhong-ming1,2, SONG Xin-han2, ZHANG Hong-bin2, CHEN Liang-si2, LUO Xiao-ning2, CHEN Shao-hua2, WU Yi-long3

(1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofOtorhinolaryngology,3GuangdongLungCancerInstitute,GuangdongGeneralHospital&GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:syylwu@live.cn;szhang555@hotmail.com)

AIM: To investigate the differential microRNA expression profiles between laryngeal cancer and adjacent normal laryngeal mucosa.METHODSForty two pairs of laryngeal cancer tissue and adjacent normal laryngeal mucosa tissue were collected. Ten pairs of samples were used for determining microRNA expression by the method of miRNA microarray chip. Data analysis was performed to find out the significant differential microRNA expression profile in laryngeal cancer, and the difference was verified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis on another 32 pairs of samples. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay and colony-forming assay were used to analyze the proliferation of Hep2 cells induced by miR-125a-5p.RESULTSBoth miRNA microarray and qRT-PCR showed that the expression of let-7f-5p, miR-10a-5p, miR-125a-5p, miR-144-3p, miR-195-5p and miR-203 was down-regulated in laryngeal cancer tissues. miR-125a-5p suppressed the proliferation of Hep2 cells.CONCLUSIONThe results of microarray are accordant with those of qRT-PCR. Significant difference of miRNA expression profiles between laryngeal cancer and adjacent normal laryngeal mucosa indicates that miRNAs may play a role in carcinogenesis and progression of laryngeal cancer. miR-125a-5p inhibits the proliferation of Hep2 cell, indicating a novel therapeutic target against laryngeal cancer.

Laryngeal neoplasms; MicroRNA; Microarray chip; Cell proliferation

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.014

1000- 4718(2013)01- 0086- 07

2012-09-24

2012-11-19

廣東省科技計(jì)劃(No.2011B031800148)；2011年第二批省級(jí)財(cái)政產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)專項(xiàng)資金(No.Z012011254)

△ 通訊作者 吳一龍 Tel: 020-83827812；E-mail: syylwu@live.cn； 張思毅 Tel: 020-83827812；E-mail: szhang555@hotmail.com