食管癌動物模型的建立

趙 強，聞丹憶，孫建和*

(1．上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海201101;2．上海睿智化學(xué)研究有限公司，上海201203)

0 引言

食管癌(esophageal carcinoma)是人類常見的惡性腫瘤之一，近年來全球食管癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢［1-2］．根據(jù)國際癌癥研究署2008年世界癌癥發(fā)病與死亡報告(Globocan 2008)估計，全球食管癌發(fā)病48．16萬例，同期全球死亡40．65萬例．食管癌發(fā)病率和死亡率在全球惡性腫瘤中排第8位和第6位［3］．食管癌的發(fā)生有明顯的地域特點，我國一直是食管癌的高發(fā)地區(qū)，食管癌發(fā)病率和死亡率均居世界之首［4-6］．研究食管癌的病因、發(fā)展轉(zhuǎn)移機制及對藥物的反應(yīng)性，對食管癌的防治有著十分重要的現(xiàn)實意義．

腫瘤動物模型為基礎(chǔ)與臨床腫瘤研究提供了很好的實驗材料，在人類腫瘤的研究中起著重要作用［7-8］．利用腫瘤動物模型可以縮短研究時間，并可在人為控制條件下進行各種實驗研究，為研究人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、生物學(xué)特性以及腫瘤治療藥物的研發(fā)提供了良好的實驗平臺［9-11］．食管癌動物模型是研究食管癌的重要實驗方法，目前尚沒有哪一種模型能夠滿足理想的食管癌動物模型的所有標準，因此對于不同特征的食管癌需要選擇最合適的動物模型．本文作者簡要回顧了現(xiàn)今常用的各種食管癌動物模型，并對食管癌動物模型建立的研究進展進行了介紹．

1 食管癌動物模型的建立及類型

食管癌動物模型與其模擬的人類食管癌在分子、組織學(xué)以及生物學(xué)特性方面有許多共同性，故可用于食管癌的病因、發(fā)病機制、發(fā)展過程及治療藥物篩選等方面的研究．食管癌動物模型主要有:自發(fā)性動物模型、誘發(fā)性動物模型、移植性動物模型和基因工程動物模型等．自20世紀中期首次獲得食管癌大鼠模型以來，隨著人們對食管癌動物模型的研究不斷深入，用來建模的動物也多種多樣，主要有小鼠、大鼠、兔、犬、豬等，其中以大鼠、小鼠最為常用［10］．目前食管癌動物模型以誘發(fā)性和移植性的應(yīng)用最為廣泛，其中移植性食管癌動物模型是當今研究人類食管癌發(fā)生、發(fā)展、生物學(xué)特性以及抗食管癌藥物篩選的最佳動物模型［12-13］．近年來基因工程食管癌動物模型在國內(nèi)、外發(fā)展很快，成為食管癌動物模型研究的熱點．

1．1 自發(fā)性食管癌動物模型

自發(fā)性食管癌動物模型是指實驗動物未經(jīng)任何有意識的人工處置，在自然情況下所發(fā)生的食管癌動物模型．該模型完全在自然條件下發(fā)生，排除了人為因素，食管癌的發(fā)生、發(fā)展過程與人類食管癌相似，主要是反映動物的腫瘤易感性、環(huán)境致癌物質(zhì)和促癌物質(zhì)的積聚程度．從理論上講該模型是很理想的食管癌動物模型，但其存在較大的局限性，如發(fā)生率低且不穩(wěn)定，發(fā)生時間較難預(yù)測且參差不齊，荷瘤動物個體在品系、性別、年齡、腫瘤發(fā)生時間、大小等均有較大的差異．由于該模型存在較多的局限性，目前已極少使用，已被其他食管癌動物模型所取代［14］．

1．2 誘發(fā)性食管癌動物模型

誘發(fā)性食管癌動物模型為致癌因素與受體動物食管部位直接或間接接觸，使食管部位產(chǎn)生腫瘤的模型．誘發(fā)性食管癌動物模型操作方法簡單，靶器官和誘癌劑恒定，誘發(fā)成瘤率高，基本模擬了食管癌變發(fā)生的過程，接近人類食管癌的發(fā)生發(fā)展過程，使人們得以有計劃、有步驟地觀察食管癌變的整個過程，是進行基礎(chǔ)和臨床食管癌研究的常用方法．目前誘發(fā)動物食管癌的方法主要有:化學(xué)法、物理法、生物法及復(fù)合因素法．有學(xué)者對近年誘發(fā)食管癌所用動物的種類進行分析，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用最多的是大鼠，其中又以SD 和 F344大鼠為主［15］．

誘發(fā)食管癌動物模型的誘發(fā)因素和條件可人為控制，模型發(fā)病過程與人類相似，且能得到相同背景下食管癌進展過程中各個病理時期的樣本，有利于開展食管癌的動態(tài)研究［16］．該模型被廣泛用于食管癌發(fā)病機制及化學(xué)預(yù)防等方面的研究．1962年，Schoental等［17］用亞硝胺成功誘發(fā)了大鼠的食管癌，甲基芐基亞硝胺(N-nitrosomethylbenzyl-amine，NMBA)是這類化合物中對大鼠食管最強的致癌物．對甲基戊基亞硝胺(Methyl-n-amyl nitrosamine，MNAN)是另一種常見的用于誘發(fā)大鼠食管癌模型的亞硝胺類化合物，與NMBA相類似．Xiang等［18］用N-亞硝基肌氨酸乙酯的前體鹽酸肌氨酸乙酯和亞硝酸鈉成功誘發(fā)大鼠食管鱗癌，其病理形態(tài)的改變與人食管鱗癌的發(fā)生相似，且可在較短時間內(nèi)誘導(dǎo)形成乳頭狀瘤和癌，被認為是研究食管癌及癌前病變較好的模型．Barch等［19］應(yīng)用NMBA誘導(dǎo)SD大鼠食管癌，用于食管癌早期癌變機制的研究．Tang等首次報道了4-NQO小鼠食管鱗癌的誘導(dǎo)模型且致癌率非常高．近年來國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用亞硝銨類化合物誘發(fā)食管癌動物模型的報道較為常見［15，20-21］．

1．3 移植性食管癌動物模型

移植性食管癌動物模型是將源于人或動物的食管癌腫瘤組織或細胞系移植到動物體內(nèi)形成食管癌的動物模型．主要包括同種移植(動物之間)和異種移植(人與動物之間)兩種．由于同種移植食管癌動物模型的研究結(jié)果并不能對臨床進行有效預(yù)測，且能獲得的鼠食管癌細胞系也較少，故該模型已經(jīng)很少使用．異種移植食管癌動物模型是目前應(yīng)用最多的食管癌動物模型［22］，是將人食管癌細胞系或食管癌組織塊直接移植到免疫缺陷小鼠皮下而建立的模型．該模型建模方法簡單，易觀察，成瘤率高，模型穩(wěn)定，并能較好地反應(yīng)腫瘤的侵襲性、生長情況、藥物敏感性等，因而成為常用的食管癌動物模型［12-13］．隨著對異種移植食管癌動物模型研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)用食管癌細胞系建立的異種移植瘤模型在食管癌研究中存在一定的局限性．主要原因是建模用的細胞系經(jīng)過多次體外處理和傳代，其組織學(xué)特征和遺傳學(xué)特性已發(fā)生了較大的改變，不能充分代表食管癌患者的多樣性和個體化．直接將臨床食管癌患者腫瘤組織接種到免疫缺陷小鼠，所建立的人源性食管癌小鼠皮下移植瘤模型，能更準確地反映食管癌患者的腫瘤特征，可以克服上述模型的缺陷和不足［22-25］．

1981年，Kitamura等［26］首次將來自食管癌患者的腫瘤組織移植到裸小鼠背部皮下，所建移植瘤模型獲得成功，且所建人源性食管癌動物模型能連續(xù)傳代，研究發(fā)現(xiàn)移植瘤的組織表型與原發(fā)瘤相似，拉開了應(yīng)用裸鼠研究食管癌的帷幕．蔡海英和許錦階在90年代初期分別先后將臨床食管癌患者腫瘤組織接種于裸小鼠，建成了能連續(xù)傳代的食管癌移植瘤模型．2001年，Wu等［27］首次用SCID小鼠建成食管癌Eca-109細胞株模型．SCID(severe combined immuno deficient)小鼠是一種嚴重聯(lián)合免疫缺陷的近交系小鼠，由于缺乏功能性B、T淋巴細胞，SCID小鼠較單純T淋巴細胞缺乏的裸小鼠更易建立人食管癌移植瘤模型［28］．國內(nèi)外已有較多的關(guān)于人源性食管癌免疫缺陷小鼠移植瘤模型的報道，可用于抗人食管癌藥物的篩選和指導(dǎo)臨床合理用藥［29-30］．建立人源性食管癌免疫缺陷小鼠皮下移植瘤的基本條件是:腫瘤標本的取材應(yīng)在無菌條件下取新鮮、無壞死、無包膜的瘤組織，手術(shù)標本應(yīng)用在1～4 h內(nèi)完成異種皮下移植，移植瘤受體動物在6周齡左右，移植的最常用部位是背側(cè)皮下［7］．通過建立穩(wěn)定的與臨床食管癌特征相似的食管癌皮下移植瘤模型，可以為研究食管癌的發(fā)病、轉(zhuǎn)移機制和對藥物耐藥反應(yīng)等提供可靠的研究基礎(chǔ)．

1．4 基因工程食管癌動物模型

誘發(fā)性和移植性食管癌動物模型是研究食管癌外在因素的必要模型，而腫瘤的發(fā)生還是體內(nèi)多種基因改變、多因素積累的綜合過程．隨著人們對機體、細胞、分子生物學(xué)特性及遺傳工程研究的深入，以上食管癌動物模型不能滿足全方位研究食管癌的需要，基因工程食管癌動物模型應(yīng)運而生［31-33］．基因工程食管癌動物模型主要有轉(zhuǎn)基因食管癌動物模型和基因敲除食管癌動物模型2種．

Zhang等［34］應(yīng)用4-硝基喹啉-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4-NQO)誘導(dǎo)p53顯性負相突變轉(zhuǎn)基因鼠口腔-食管癌，發(fā)現(xiàn)食管癌的成功率有了很大的提高．已知鋅缺乏在食管癌的發(fā)生中起著重要的作用，補鋅可以逆轉(zhuǎn)異常的基因表達和過度增殖．在基因工程小鼠中，鋅缺乏結(jié)合抑癌基因p53缺陷［35］或COX-2的敲除［36-38］，在低劑量化學(xué)致癌原誘導(dǎo)下就可導(dǎo)致食管癌迅速發(fā)生，且進展更快．目前基因工程食管癌動物模型在國內(nèi)外的開展還比較少，且模型制作技術(shù)要求高，價格昂貴．因此所建立的基因工程食管癌動物模型成功率相對較低［39］．但其為食管癌的基礎(chǔ)理論和臨床應(yīng)用研究開辟了更理想的研究途徑，具有廣闊的前景，是食管癌動物模型未來發(fā)展的方向之一．

1．5 其他食管癌動物模型

Barrett食管(Barrettp′s esophag us，BE)是指食管下段的復(fù)層鱗狀上皮被單層柱狀上皮替代的一種病理現(xiàn)象．大量的臨床研究顯示，BE先于食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)發(fā)生，支持由BE到黏膜不典型增生、原位癌、最后發(fā)展為浸潤性腺癌的病理過程［40］．Goldstein等對大鼠進行食管十二指腸吻合術(shù)(esophagoduodenal anastonlcvsis，EDA)從而造成食管返流，發(fā)現(xiàn)手術(shù)后動物可能由于鐵吸收減少而發(fā)生貧血，當補給鐵劑;在30周后有73%的動物發(fā)生EAC，其發(fā)病機制在許多方面同人類 EAC的發(fā)病機制相似．Chen等［41］利用此模型進行補充抗氧化劑Vit-E和硒的研究，試驗證明補硒組EAC的發(fā)生率和腫瘤體積增加，而補充Vit-E組抑制了癌變發(fā)生，因此認為Vit-E可能通過其抗氧化特性而阻止腺癌的形成，而大劑量的無機硒可能通過增強氧化而促進癌的形成．可見EDA對研究EAC的發(fā)生及預(yù)防是很好的動物模型，還適合對EAC進行廣泛的抗氧化性損傷及生物標志的研究［42］．

食管癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素、多階段累積的綜合動態(tài)過程．為深入研究食管癌的生物學(xué)特征，提高抗食管癌藥物篩選的臨床針對性和臨床試驗成功率，需要建立與食管癌患者病因、發(fā)病機制、發(fā)展過程及治療相似的動物模型．以上5種類型的食管癌動物模型在應(yīng)用方面各有千秋．現(xiàn)就5種食管癌動物模型各自的特點總結(jié)(表1)．

2 食管癌動物模型的監(jiān)測方法

2．1 一般性評價

食管癌動物模型建立后需要監(jiān)測腫瘤的生長情況，并對建立模型的方法進行評價．首先對動物的日?；顒有袨?、攝食飲水、體重及腫瘤的生長潛伏期等進行常規(guī)調(diào)查;待腫瘤形成后，定期進行腫瘤體積和動物體重的調(diào)查，并觀察腫瘤形態(tài)及有無消退情況的發(fā)生等．同時需定期安樂死荷瘤鼠，分離出腫瘤組織，觀察腫瘤形狀、活動度、質(zhì)地及有無壞死灶，并用中性福爾馬林溶液固定腫瘤組織，進行病理組織學(xué)鑒定，還可運用分子生物學(xué)研究對所建模型腫瘤標志物進行檢測等．尸體解剖后觀察荷瘤鼠主要臟器有無侵襲、轉(zhuǎn)移等情況．

表1 不同類型食管癌動物模型比較

2．2 MRI顯像技術(shù)

核磁共振成像(MRI)技術(shù)在腫瘤診斷中十分重要，能動態(tài)觀察活體動物腫瘤生長情況及腫瘤生長過程中與周圍組織的相互作用，是一種無創(chuàng)傷的動態(tài)觀測．MRI技術(shù)的組織分辨率高，成像清晰，可同時獲得檢測部位的解剖與生理信息，適合用于小動物的成像檢查．國外進行裸鼠腫瘤MRI研究多采用高場強(3．0～9．4 T不等，甚至更高)動物MRI專用掃描儀和裸鼠專用動物線圈，所獲圖像信噪比和對比度優(yōu)良［43］;馮仕庭等［44］人采用3．0 T的超高場MRI掃描儀對建立的動物模型進行檢測，實驗裸鼠的MRI圖像顯示腫瘤組織、肝臟和肌肉具有很高的信噪比，表明MRI用于裸鼠檢測成像質(zhì)量較高，對觀察小鼠腫瘤具有良好的應(yīng)用價值．

2．3 活體熒光成像技術(shù)

活體生物熒光成像技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種分子生物學(xué)檢測技術(shù)，用于分子、基因表達的分析檢測．運用該檢測方法，研究人員能夠直接監(jiān)控活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移生物學(xué)過程．此外，還可以動態(tài)觀測腫瘤細胞的運動，甚至能夠觀察到小的轉(zhuǎn)移灶．目前，熒光標記技術(shù)已經(jīng)被較廣泛地應(yīng)用到腫瘤的研究中，研究人員運用該技術(shù)成功地觀察到腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移和血管再生過程［45-46］．近年來國內(nèi)外很多學(xué)者均成功應(yīng)用該技術(shù)，對各自所建的小鼠腫瘤模型進行了動態(tài)的全程監(jiān)測［47-48］．活體成像技術(shù)是目前發(fā)展較快的技術(shù)，是一種較理想的動態(tài)監(jiān)測腫瘤生長情況的方法，隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的深入和腫瘤特異性蛋白的發(fā)現(xiàn)，其運用將更廣泛［49-50］．

3 小結(jié)

理想的食管癌動物模型應(yīng)該能較好地模擬食管癌形成的自然過程，并能體現(xiàn)出食管癌發(fā)生、發(fā)展的主要特點．鑒于腫瘤的發(fā)生是多種環(huán)境因素改變和多個靶細胞基因改變相互累積和作用的綜合過程，同時食管癌在遺傳特性、臨床表現(xiàn)及預(yù)后方面具有復(fù)雜的異質(zhì)性．因此，單一的食管癌動物模型并不能完全反映腫瘤發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性．隨著研究的深入以及各種技術(shù)的完善，人們將逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)病機制、腫瘤與宿主的關(guān)系、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過程、藥物耐受性等，從而建立起與人食管癌更相近的動物模型．將為抗食管癌藥物的篩選和臨床個體用藥方案提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)．

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