小鏈霉菌HCCB10043敲除硫酯酶基因的工程菌株構(gòu)建及其代謝產(chǎn)物的研究

尹 芳，饒 敏，魏 維，陳玲玲，陳代杰

(1．上海來(lái)益生物藥物研發(fā)中心生物Ⅱ?qū)嶒?yàn)室，上海200240;2．上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海200240)

0 引言

近十年來(lái)，伴隨著基因組測(cè)序的高速發(fā)展，基因組測(cè)序揭示了許多鏈霉菌具有大量潛在的、與已知抗生素的生物合成基因類似的基因．例如，枯草芽孢桿菌的基因組密碼中，存在多于4%的基因可能是聚酮化合物和桿菌素的基因簇．模型菌Streptomyces coelicolor和工業(yè)菌株Streptomyces avermitilis的基因組序列分別揭示有20個(gè)和30個(gè)基因簇與次級(jí)代謝有關(guān)，主要為聚酮合酶(PKS)和非核糖體肽(NRPS)合成酶［1-2］，這些結(jié)果是出乎意料的，因?yàn)樵诖酥?，從每一個(gè)菌株中只確定了少數(shù)生物活性化合物．所以，可能有許多有用的化合物在常規(guī)篩選條件下沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)或在實(shí)驗(yàn)室條件下沒(méi)有產(chǎn)生．未表達(dá)的基因簇被叫做沉默的或“隱藏的”基因，它們代表著數(shù)量可觀的潛在新藥．這些沉默的細(xì)菌素、PKS和NRPS基因簇引起微生物學(xué)家的極大興趣．

小鏈霉菌HCCB10043主要代謝產(chǎn)物為脂肽類物質(zhì)A21978C，基因組序列揭示該菌體中存在多條類型為PKS、NRPS或PKS-NRPS混合的物質(zhì)合成途徑，聯(lián)二吡啶類化合物的發(fā)現(xiàn)就是一個(gè)很好的證明．通過(guò)基因敲除和培養(yǎng)條件的改變，找到菌株代謝產(chǎn)物組中不同化合物生物合成途徑之間的關(guān)系，可以為闡明代謝物組、進(jìn)而提高A21978C產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)，也為新藥研究提供化合物基礎(chǔ)．

有報(bào)道稱，Ⅱ型TE pikAV敲除后導(dǎo)致其目的產(chǎn)物的產(chǎn)量降低95%，而Butler［3］等在研究泰樂(lè)菌素(tylosin)生物合成基因簇TEⅡtylO敲除時(shí)發(fā)現(xiàn)突變株的22份發(fā)酵樣本中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量很低但各不相同，范圍從野生菌株產(chǎn)量的15%到無(wú)不等，所以TEⅡ的缺失會(huì)嚴(yán)重影響相應(yīng)目的產(chǎn)物的合成．

1 材料與方法

1．1 菌株與質(zhì)粒

鏈霉菌:小鏈霉菌 HCCB10043(上海來(lái)益生物藥物研發(fā)中心保藏);大腸桿菌:E．coli DH5α、ET12567/pUZ8002(上海來(lái)益生物藥物研發(fā)中心保藏);質(zhì)粒:pMD18-T Simper Vector(日本TAKARA公司);pKC1139(Amr)(上海來(lái)益生物藥物研發(fā)中心保藏)．

1．2 試 劑

與DNA相關(guān)操作試劑均由日本TAKARA公司提供;所有抗生素由上海生工進(jìn)口分裝;EB溶液(10mg/mL)由上海生工生物提供;純化PCR產(chǎn)物試劑盒由上海萊楓生物有限公司提供．

1．3 培養(yǎng)基

(1)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基、2×YT培養(yǎng)基、TSB合成培養(yǎng)基．

(2)MS固體培養(yǎng)基(g/L):甘露醇20、熟黃豆餅粉20、瓊脂粉20．

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉 20、NaNO32．0、CaCO32．0、K2HPO41．0、KCl 0．5、MgSO4·7H2O 0．5．

1．4 方 法

1．4．1 小鏈霉菌培養(yǎng)

(1)斜面孢子培養(yǎng):MS斜面培養(yǎng)基上接種，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d．

(2)搖瓶種子培養(yǎng):將從斜面輕刮下面積0．5 cm2左右的孢子接種到含25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28℃，240 r/min條件下培養(yǎng)42 h．

(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):種子培養(yǎng)42 h后將2 mL種子液加入到含25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28℃，240 r/min條件下培養(yǎng)4 d．

(4)液體試管培養(yǎng):以無(wú)菌槍頭挑取少量孢子或吸取少量菌液于裝有3 mL TSB的小試管中(加2～3粒玻璃珠)，置于28℃搖床中，240 r/min振蕩培養(yǎng)2 d．

1．4．2 大腸桿菌的培養(yǎng)

大腸桿菌的活化及液體培養(yǎng)．

1．4．3 與DNA相關(guān)的操作

(1)菌株染色體DNA的提取方法參見文獻(xiàn)［4］．堿變法提質(zhì)粒．

表1 特異型引物堿基序列

(3)PCR 反應(yīng)體系:10×GC Buffer 12．5 μL;dNTP 2 μL;上游引物0．25 μL;下游引物0．25 μL;模板 DNA 0．5 μL;Prime STAR DNA polymerase(5 U/μL)0．25 μL;補(bǔ)水至總體積25 μL．

PCR反應(yīng)條件:98℃ 1 min、72℃ 1 min共30循環(huán);72℃ 4 min;4℃終止．

1．4．4 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

以溫敏型質(zhì)粒pKC1139為載體，連接上下游兩條同源臂后構(gòu)建成為可供基因改造的基因敲除質(zhì)粒pKC1139-TE．

1．4．5 工程菌的構(gòu)建

1．4．5．1 敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株HCCB10043

采用接合轉(zhuǎn)移的方法，將已經(jīng)成功構(gòu)建的敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)入小鏈霉菌HCCB10043中．具體步驟參見文獻(xiàn)［2］．

1．4．5．2 篩選突變菌株

旅游小鎮(zhèn)建設(shè)開發(fā)要適度，生態(tài)環(huán)境保護(hù)是第一要?jiǎng)?wù)，在保障生態(tài)環(huán)境的前提下漸進(jìn)發(fā)展，如何平衡開發(fā)與保護(hù)，和諧發(fā)展，是武陵山鄉(xiāng)旅游小鎮(zhèn)建設(shè)的重要挑戰(zhàn)。

以安普霉素為抗性標(biāo)記，對(duì)比篩選突變菌株．

1．4．6 發(fā)酵液處理

以等體積甲醇浸泡同體積發(fā)酵液，12 h后，將混合液于12000 r/min離心30 min，棄沉淀;浸提液作為待測(cè)試樣品．

1．4．7 樣品的UPLC-Q-TOF-MS分析

浸提液由上海交大分析測(cè)試中心進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS分析測(cè)試．

流動(dòng)相配制:A為0．1%甲酸水溶液，B為0．1%甲酸乙腈;色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(2．1 ×100 mm，1．7 μm);柱溫:40℃;檢測(cè)器:DAD(HP1100)檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):210、245、280、390 nm;流速:0．4 mL/min;洗脫梯度見表2．

表2 流動(dòng)相配制比例

MS參數(shù):毛細(xì)管電壓3．0 kV，錐孔電壓35 V，源內(nèi)溫度100℃，干燥氣流溫度250℃，干燥器流速400 L/h;碰撞能MS 6 eV、MS-MS35 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z800～2000，掃描時(shí)間1 s，掃描間隔時(shí)間0．02 s．

2 結(jié)果與分析

2．1 目的基因上下游同源臂基因序列的克隆

利用設(shè)計(jì)的引物，以HCCB10043基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增目的基因上下游序列(圖1左)，回收需末端加“A”，克隆到pMD18-T(3Kb左右)載體．提取克隆后的質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證(圖1右)并回收純化．

圖1 DNA片段電泳圖

2．2 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pKC1139，回收純化的線性質(zhì)粒與目的基因的上下游同源臂同時(shí)連接(流程如圖2所示)，轉(zhuǎn)入E．coli DH5α擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證，雙酶切后質(zhì)粒、同源臂長(zhǎng)度分別為6．5 Kb和2 Kb，單酶切后敲除質(zhì)粒長(zhǎng)度為8．5 Kb(圖3)．經(jīng)驗(yàn)證正確后，得到敲除質(zhì)粒pKC1139-TE．

圖2 敲除質(zhì)粒構(gòu)建流程

圖3 敲除質(zhì)粒酶切后電泳圖

圖4 菌株驗(yàn)證電泳圖

2．3 HCCB10043突變菌株基因型的驗(yàn)證結(jié)果

以敲除目的基因的上下游同源臂連接后的片段為DNA模板，設(shè)計(jì)檢驗(yàn)引物，PCR驗(yàn)證同源臂之間目的基因長(zhǎng)度，電泳檢驗(yàn)條帶見圖4．陰性對(duì)照以原始菌株基因組DNA為模板，陽(yáng)性對(duì)照以敲除質(zhì)粒為模板，雙交換突變菌株條帶長(zhǎng)度與陽(yáng)性對(duì)照一致．

2．4 突變菌株發(fā)酵結(jié)果

菌株HCCB10043-Δ226在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵液UPLC-Q-TOF-MS結(jié)果見圖5，其中主要產(chǎn)物產(chǎn)量變化見表3．

菌株HCCB10043在M7發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生COL-C、COL-A、SF2738F這3個(gè)新的物質(zhì)，通過(guò)對(duì)圖譜中3個(gè)物質(zhì)的對(duì)比與分析，發(fā)現(xiàn)與原始菌株相比，敲除HCCB10043中基因簇226的硫酯酶結(jié)構(gòu)域以后，COL-C、COL-A、SF2738F 的產(chǎn)量分別下降了 46．7%、52．8%、4．9%．

表3 發(fā)酵液中主要產(chǎn)物產(chǎn)量相對(duì)變化值(10043發(fā)酵產(chǎn)量為100%)

圖5 發(fā)酵液:HCCB10043(上)HCCB10043-Δ226(下)

3 討論

NRPS或I型PKS產(chǎn)物的釋放機(jī)制是由I型TE介導(dǎo)的．I型TE通常位于PKS或NRPS最后一個(gè)模塊的C-端，屬于α/β水解酶超級(jí)家族．TE I通過(guò)三聯(lián)體活性中心催化產(chǎn)物的釋放．與I型TE不同，有些TE游離于PKS生物合成基因簇的外部，被稱作Ⅱ型TE．目前對(duì)Ⅱ型TE功能的研究認(rèn)為TEⅡ在PKS或NRPS合成過(guò)程中具有編輯或糾錯(cuò)的功能，但是對(duì)于一些沒(méi)有TE I只有TEⅡ的PKS或NRPS來(lái)說(shuō)，TEⅡ行使的是TE I的功能．關(guān)于TEⅡ的研究相對(duì)較少，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的苦霉素生物合成基因簇的pikAV，泰樂(lè)菌素生物合成簇的tylO都屬于Ⅱ型TE［5］．

工程菌HCCB10043-Δ226是一株敲除了一個(gè)TE結(jié)構(gòu)域的突變株，該結(jié)構(gòu)域位于聯(lián)二吡啶類抗生素生物合成基因簇的末端，為Ⅱ型TE，對(duì)合成產(chǎn)物起到糾錯(cuò)的作用，但也可能只具有水解釋放化合物的作用．在最適宜的培養(yǎng)條件下，基因簇的合成產(chǎn)物因?yàn)槟┒薚E基因的敲除使得相應(yīng)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量降低，本試驗(yàn)結(jié)果顯示COL-C、COL-A、SF2738F 3種物質(zhì)產(chǎn)量均下降，其中COL-A降幅最高達(dá)到52．8%，驗(yàn)證了Ⅱ型TE在聯(lián)二吡啶類代謝產(chǎn)物合成途徑中的重要作用，但因?yàn)橄鄳?yīng)代謝物質(zhì)只是產(chǎn)量上的差異，推測(cè)硫酯酶在合成途徑中的非必需作用．同時(shí)，根據(jù)物質(zhì)守恒這一通用法則，菌體從外界環(huán)境吸收利用的物質(zhì)的總量是有限的，那么物質(zhì)流向成為不同代謝產(chǎn)物量或質(zhì)的差別的關(guān)鍵．因此，通過(guò)相關(guān)代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的敲除，人為地抑制或關(guān)閉菌體中非目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成，使代謝流發(fā)生變化，使底物更多地用于目標(biāo)化合物的合成．所以，本試驗(yàn)結(jié)果為A21978C產(chǎn)量的提高提供了可能性探索．

［1］BENTLEY SD，CHATER K F，CERDENO-TARRAGA A M，et al．Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2)［J］．Nature，2002，417(6885):141-147．

［2］IKEDA H，ISHIKAWA J，HANAMOTO A，et al．Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis［J］．Nature，2003，21(5):526-531．

［3］BUTLER A R，BATE N，CUNDLIFFE E．Impact of thioesterase activity on tylosin biosynthesis in Streptomyces fradiae［J］．Chem Biol，1999，6(5):287-292．

［4］SAMBROOK J，RUSSELL D W．Molecular cloning:a laboratory manual［M］．3rd edn．Cold Spring Harbor:Cold Spring Harbor Laboratory，2001．

［5］CLAXTON H B，AKEY D L，SILVER M K，et al．Structure and functional analysis of RifR，the type Ⅱ thioesterase from the rifamycin biosynthetic pathway［J］．JBiol Chem，2009，284(8):5021-5029．