利用分子標(biāo)記分析22種上海市重要水稻10個(gè)食味品質(zhì)相關(guān)基因的基因型

謝米雪，郭 亮，竇蘭蘭，曹月琴，李建粵*

(1．上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)中心，上海200234;2．上海市閔行區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，上海201103)

稻米食味品質(zhì)的評(píng)定主要包括3個(gè)理化指標(biāo)，即直鏈淀粉含量(AC)、膠稠度(GC)和糊化溫度(GT)．優(yōu)良食味品質(zhì)稻米具有較低的AC，較高的GC及較低的GT［1-3］．Tian等［4］認(rèn)為，有10個(gè)基因位點(diǎn):Wx、SSII-3、SBE3、AGPiso、SSIV-2、ISA、AGPlar、SSI、SSIII-2、PUL，對(duì)稻米食味品質(zhì)指標(biāo)影響較大．其中，決定稻米直鏈淀粉含量的主效基因是Wx;另外，SSII-3對(duì)稻米直鏈淀粉的合成影響也較大;SSIII-2、AGPlar、PUL和SSI 4個(gè)基因?qū)Φ久字辨湹矸酆铣删哂形⑿ё饔茫绊懩z稠度的主效基因也是Wx，微效基因主要有AGPiso、ISA和SBE3．而影響糊化溫度的主效基因是SSII-3，微效基因是Wx、ISA、SBE3及SSIV-2．

隨著稻米食味品質(zhì)相關(guān)基因研究的深入，不少相關(guān)的分子標(biāo)記已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)，有的已經(jīng)得到實(shí)際應(yīng)用．孫華欽等［5］根據(jù)糯性水稻與非糯性水稻W(wǎng)x序列位點(diǎn)的差異，設(shè)計(jì)了兩個(gè)可以特異識(shí)別糯性水稻的STS分子標(biāo)記．Cai等［6］根據(jù)Wx第1內(nèi)含子5’端剪切處的GT/TT位點(diǎn)的多態(tài)性與直鏈淀粉含量直接有關(guān)的特性，發(fā)展了一個(gè)CAPS(Acc I)分子標(biāo)記，可區(qū)分稻米是屬于中等直鏈淀粉含量還是高直鏈淀粉含量水稻．Bao等［7］根據(jù) SSII-3的 GC/TT多態(tài)性，開(kāi)發(fā)了檢測(cè) SSII-3的分子標(biāo)記．Han等［8］根據(jù)SBE3 3’UTR的SNP差異(C/G)，開(kāi)發(fā)了一個(gè)CAPS(Spe I)標(biāo)記．田志喜等［9］已開(kāi)發(fā)了涉及10個(gè)食味品質(zhì)基因型鑒定的分子標(biāo)記．

明確影響稻米食味品質(zhì)功能基因，可為利用分子標(biāo)記輔助選育優(yōu)質(zhì)食味品質(zhì)水稻新品種研究奠定重要基礎(chǔ)．然而，在涉及利用具體水稻品種作為親本進(jìn)行雜交育種前，必需先明確所使用的親本材料涉及食味品質(zhì)相關(guān)基因的類型．本研究將結(jié)合利用現(xiàn)有報(bào)道［5-10］和本研究建立的分子標(biāo)記，對(duì)22種目前在上海市主栽的常規(guī)水稻和雜交水稻親本進(jìn)行10個(gè)與稻米食味品質(zhì)相關(guān)基因的基因型分析．

1 材料與方法

1．1 水稻材料及基因組DNA提取

22種上海市主栽常規(guī)水稻以及雜交稻親本水稻品種或品系分別為:“秀水128”、“秀水123”、“秀水114”、“秀水134”、“光明粳一號(hào)”、“楊粳4227”、“武運(yùn)粳23”、“寶農(nóng)34”、“金豐”、“銀香 18”、“寒豐A”、“秋風(fēng) A”、“申9A”、“湘晴”、“R44”、“繁14”、“南粳46”、“滬嘉香軟”、“青香軟粳”、“1013”、“紫香糯861”、“滆湖香糯”．作為食味品質(zhì)基因不同基因型鑒定的對(duì)照水稻品種分別有:“93-11”、“中旱3”、“蘇玉糯”、“太湖糯”、“IR36”、“IR64”．

所有水稻材料取幼嫩葉片進(jìn)行基因組DNA的提?。?/p>

1．2 22種水稻基因型分析

參考前人報(bào)道，分別合成能夠擴(kuò)增 Wx［5-6，10］、SSII-3［7］、SBE3［8］和 AGPiso［9］4 個(gè)基因包含 6 個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的引物序列(表1)．參照GenBank中公布的水稻W(wǎng)x(GQ151055．1)基因序列，在Wx第4外顯子+693脫氧核苷酸位點(diǎn)兩端，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)上游和下游引物(表1);同樣參照GenBank中公布的水稻 SSIV-2(GQ151051．1)、ISA(GQ150876．1)、AGPlar(GQ150834．1)、SSI(GQ150946．1)、SSIII-2(GQ151016．1)和PUL(GQ150890．1)基因序列，在Tian等［4］報(bào)道的多態(tài)性位點(diǎn)兩端利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)上游和下游引物(表1)．引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成．基因測(cè)序采用KOD酶，并將不同引物分別對(duì)所有水稻基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增．不同基因擴(kuò)增的反應(yīng)程序，除了退火溫度和延伸時(shí)間有差異(表1)，其他程序均為:94℃預(yù)變性2 min、94℃變性15 s、退火30 s、68℃延伸，共32個(gè)循環(huán)，最后68℃延伸10 min．PCR產(chǎn)物直接電泳鑒定或酶切后鑒定采用Taq酶，不同基因擴(kuò)增的反應(yīng)程序，除了退火溫度和延伸時(shí)間有差異(表1)，其他程序均為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s、退火30 s、72℃延伸，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min．

表1 食味品質(zhì)相關(guān)基因基因型鑒定涉及的引物序列及相關(guān)信息

續(xù)表1 食味品質(zhì)相關(guān)基因基因型鑒定涉及的引物序列及相關(guān)信息

將ISA、AGPlar、SSI、SSIII-2、PUL擴(kuò)增產(chǎn)物以及針對(duì)Wx 5′UTR位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定與預(yù)測(cè)分子量一致后(表1)，送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析．對(duì)于SSII-3擴(kuò)增產(chǎn)物直接采用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)．SSIV-2以及Wx第2外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，需采用4%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析．對(duì)于Wx第1內(nèi)含子、Wx第4外顯子、SBE3以及AGPiso 4種基因擴(kuò)增產(chǎn)物，需分別采用Acc I、Nla III、Spe I和Eco RI限制性核酸內(nèi)切酶切后，再利用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)．Wx 5′UTR、ISA、AGPlar、SSI、SSIII-2和 PUL擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果用 DNAMAN 軟件進(jìn)行分析，并將后5個(gè)基因中涉及食味品質(zhì)高相關(guān)性位點(diǎn)處的核苷酸與Tian等報(bào)道［4］進(jìn)行比對(duì)．在進(jìn)行基因高相關(guān)性位點(diǎn)核苷酸分析時(shí)，將翻譯起始密碼子ATG中第一個(gè)核苷酸A定為+1，A上游的核苷酸用“–”表示，反之用“+”表示．

2 結(jié)果與分析

2．1 22種水稻W(wǎng)x基因4個(gè)位點(diǎn)分析

Tian等［4］根據(jù) Wx–1160與 +111兩處的核苷酸差異，將Wx分為三種基因型．Ⅰ型在–1160處為T，在+111處有23個(gè)核苷酸插入．Ⅱ型和Ⅲ型在+111處都無(wú)核苷酸插入，但在–1160處分別為T和G．使用孫華欽等［5］設(shè)計(jì)的STS類型分子標(biāo)記 We–2檢測(cè) Wx，I型Wx的PCR產(chǎn)物大小為204 bp，Ⅱ或Ⅲ型PCR產(chǎn)物大小為181bp，所以電泳檢測(cè)能夠?qū)x的Ⅰ型與Ⅱ或Ⅲ型區(qū)分開(kāi)．22種水稻檢測(cè)結(jié)果顯示，只有“紫香糯861”和“滆湖香糯”為Ⅰ型 Wx(圖1)．采用 Cai等［6］設(shè)計(jì)的 CAPS(Acc I)分子標(biāo)記 PCR-Acc I檢測(cè) Wx，Ⅲ型 Wx PCR產(chǎn)物可被Acc I酶切，產(chǎn)生一條分子量為403 bp的條帶，而Ⅱ型Wx PCR產(chǎn)物不能被Acc I酶切，分子量仍然為460 bp．22種水稻檢測(cè)結(jié)果顯示，其余20種水稻都為Ⅱ型Wx(圖2)．

圖1 We-2對(duì)22種水稻W(wǎng)x基因型檢測(cè)

圖2 PCR-Acc I分子標(biāo)記對(duì)20種水稻W(wǎng)x基因型檢測(cè)

22種水稻中的“南粳46”是一個(gè)含有暗胚乳特性的軟米水稻［11］．本研究根據(jù)Wang［11］等報(bào)道的軟米水稻與非軟米水稻第4外顯子+693處G/A的差異，建立了一個(gè)CAPS(Nla III)分子標(biāo)記Wx-Nla III檢測(cè)方法，并對(duì)22種水稻基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“滬嘉香軟”、“青香軟粳”和“1013”水稻與“南粳46”水稻一樣(圖3)，均有380和170 bp兩條帶，屬于軟米水稻，其他水稻DNA擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后都只有一條557 bp大小的條帶，表明它們不具有與“南粳46”水稻一樣的Wx．

圖3 Wx-Nla III對(duì)22種水稻W(wǎng)x基因型檢測(cè)

另有文獻(xiàn)報(bào)道［12］，Wx在第1內(nèi)含子上游–1216處(5′UTR)的CT重復(fù)數(shù)(CT)n與稻米直鏈淀粉含量呈反相關(guān)，即CT重復(fù)越高，稻米直鏈淀粉含量越低．因此，本研究利用郭亮等［10］設(shè)計(jì)的SSR標(biāo)記分析了22種水稻W(wǎng)x 5′UTR的CT重復(fù)．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“寶農(nóng)34”、“金豐”、“銀香18”和“紫香糯861”都具有(CT)18，其余18種水稻在Wx–1216處都為(CT)17．

2．2 22種水稻SSII－3基因型分析

采用Bao等［7］設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記SSII-3 M1檢測(cè)SSII-3，GC型SSII-3 PCR產(chǎn)物有分子量為544 bp條帶，TT型SSII-3 PCR產(chǎn)物有分子量為828 bp條帶．22種水稻檢測(cè)結(jié)果顯示，只有“紫香糯861”水稻的SSII-3基因型為GC型，其余21種水稻都屬TT型(圖4)．

圖4 SSII-3 M1對(duì)22種水稻SSII-3基因型檢測(cè)

2．3 22種水稻SBE3基因型的分析

采用Han等［8］設(shè)計(jì)的CAPS(Spe I)分子標(biāo)記檢測(cè)SBE3，Ⅱ型SBE3 PCR產(chǎn)物可被Spe I酶切開(kāi)，產(chǎn)生一條分子量為293 bp的條帶和一條分子量為217 bp的條帶，而Ⅰ型SBE3 PCR產(chǎn)物不能被Spe I酶切，分子量仍然為510 bp．22種水稻檢測(cè)結(jié)果顯示，只有“湘晴”、“R44”和“繁14”為Ⅰ型，其余19種水稻都屬于Ⅱ型(圖5)．

2．4 22種水稻AGPiso基因型分析

利用田志喜等［9］報(bào)道的CAPS(Eco RI)類分子標(biāo)記AGPiso M3檢測(cè)AGPiso，Ⅰ型PCR產(chǎn)物不能被Eco RI識(shí)別，片段大小為427 bp，Ⅱ型PCR產(chǎn)物能夠被酶切成316 bp和111 bp兩段．22種水稻檢測(cè)結(jié)果顯示，“紫香糯861”為AGPisoⅠ型，其余21個(gè)水稻品種為Ⅱ型AGPiso(圖6)．

圖5 22種水稻SBE3基因型檢測(cè)

圖6 AGPiso M3對(duì)22種水稻AGPiso基因型檢測(cè)

2．5 22種水稻SSIV－2基因型分析

Tian等［4］認(rèn)為，SSIV-2對(duì)稻米糊化溫度具有影響的高相關(guān)性位點(diǎn)位于第1內(nèi)含子的+437 bp處．根據(jù)該位點(diǎn)的差異，SSIV-2可以分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種基因型．本研究根據(jù)Ⅰ型和Ⅱ型SSIV-2在+437 bp處的差異建立了分子標(biāo)記SSIV-2(+437)，并對(duì)22種水稻基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)．結(jié)果顯示，22種水稻都為Ⅰ型SSIV-2(圖7)．

圖7 SSIV-2(+437)對(duì)22種水稻W(wǎng)x基因型檢測(cè)

2．6 22種水稻ISA基因型的分析

Tian等［4］認(rèn)為，依據(jù)起始密碼子上游-1499和-1326處的不同核苷酸，將ISA分為兩種Ⅰ型和兩種Ⅱ型．-1499處是C為Ⅰ型，在–1326處無(wú)AT核苷酸插入為Ⅰ型．-1499處是G為Ⅱ型，在-1326處有AT插入為Ⅱ型．經(jīng)過(guò)對(duì)ISA PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，22種水稻的ISA在-1499處都是Ⅰ型，而在-1326處都是Ⅱ型．

2．7 22種水稻AGPlar基因型分析

根據(jù)Tian等［4］報(bào)道，AGPlar對(duì)稻米直鏈淀粉含量有影響的高相關(guān)性核苷酸位點(diǎn)位于起始密碼子上游-1633處．根據(jù)這個(gè)位點(diǎn)核苷酸的差異，AGPlar可以分為兩種基因型．Ⅰ型在-1633處為C，Ⅱ型在-1633處為T，22種水稻AGPlar測(cè)序結(jié)果顯示，在-1633處都為T，因此，22種水稻AGPlar的基因型都為Ⅱ型．

2．8 22種水稻SSI基因型分析

Tian等［4］研究顯示，SSI對(duì)稻米直鏈淀粉含量產(chǎn)生影響的高相關(guān)性核苷酸位點(diǎn)在第4內(nèi)含子的+3216處．根據(jù)這位點(diǎn)核苷酸差異，SSI可以分為兩種基因型．Ⅰ型在+3216處為T，Ⅱ型在+3216處為A，22種水稻測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們?cè)赟SI的+3216處都為A，由此表明，22種水稻SSI基因型都為Ⅱ型．

2．9 22種水稻SSIII－2基因型分析

在Tian等［4］報(bào)道中提出，位于SSIII-2起始密碼子上游-1078處的核苷酸差異構(gòu)成了SSIII-2影響稻米直鏈淀粉含量的高相關(guān)性位點(diǎn)．根據(jù)這個(gè)位點(diǎn)核苷酸的差異，可以將SSIII-2分為兩種基因型．Ⅰ型在-1078處為T，Ⅱ型在該處為C，測(cè)序結(jié)果表明，22種水稻在-1078處都為C，它們的SSIII-2基因型都為Ⅱ型．

2．10 22種水稻PUL基因型分析

PUL對(duì)稻米直鏈淀粉含量產(chǎn)生影響的高相關(guān)性位點(diǎn)，是位于+855處的核苷酸［4］．根據(jù)這處位點(diǎn)核苷酸的差異，可以將PUL分為兩種基因型．Ⅰ型在+855為C，Ⅱ型在+855處為T，22種水稻測(cè)序結(jié)果表明，它們?cè)?855處都為T，因此，它們的PUL基因型都屬于Ⅱ型．

3 討論

具有較低的直鏈淀粉含量(AC)、較高膠稠度(GC)及較低糊化溫度(GT)的稻米一般都具有較好食味品質(zhì)．Tian等認(rèn)為，含Ⅰ型AGPlar、PUL、SSI、SSIII-2的稻米，AC明顯比基因型為Ⅱ型的高;AGPiso、SBE3、ISA(-1326)基因型為Ⅰ型的GC明顯比基因型為Ⅱ型的GC低．GT一般用堿消值(ASV)表示，ASV與GT成反相關(guān)．含Ⅰ型ISA(–1499)和Ⅰ型SSIV-2稻米的堿消值高于Ⅱ型［4］．Bao等［7］對(duì)506種水稻品種SSII-3 GC/TT多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，GC型水稻品種具有比較高的GT，而TT型水稻品種具有相對(duì)低的GT．根據(jù)Tian等［4］對(duì)不同食味品質(zhì)基因型評(píng)價(jià)，在本研究使用的22種水稻中，“紫香糯861”水稻含有相對(duì)較多不良食味品質(zhì)基因型．3種雜交稻:“寒優(yōu)湘晴”、“秋優(yōu)金豐”和“花優(yōu)14”對(duì)應(yīng)的父本，“湘晴”、“R44”和“繁14”的食味品質(zhì)基因型比這3種雜交稻母本，“寒風(fēng)A”、“秋風(fēng)A”和“申9A”以及其他常規(guī)稻有欠缺．

Tian等［9］利用49個(gè)分子標(biāo)記對(duì)64個(gè)品種的基因型分析結(jié)果表明，同一地方不同品種的食味品質(zhì)基因型比較相似．據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［13］，在比較亞洲水稻品種Wx等位基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，野生稻與栽培稻相比，栽培稻在長(zhǎng)期的篩選過(guò)程中人們所喜愛(ài)的好的基因型被積累下來(lái)，然而，這一過(guò)程也導(dǎo)致栽培稻基因中喪失了很多核苷酸多態(tài)性．本研究對(duì)22個(gè)上海市重要水稻10個(gè)食味品質(zhì)基因型分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這22種水稻中，盡管有個(gè)別水稻有些基因不屬于優(yōu)質(zhì)食味品質(zhì)基因型，但大多水稻品種都具有比較良好的食味品質(zhì)基因型．這可能也是由于一些好的食味品質(zhì)基因在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中人為地被篩選保留下來(lái)了．

Aryes等［12］研究認(rèn)為，Wx第1內(nèi)含子上游的CT重復(fù)數(shù)與稻米直鏈淀粉含量呈反相關(guān)，并提出CT重復(fù)越高，稻米直鏈淀粉含量越低的觀點(diǎn)．Tan等［14］分析了在74種水稻材料中的CT重復(fù)多態(tài)性及其與直鏈淀粉含量(AC)的關(guān)系，這些品種包括了秈稻，粳稻和普通野生稻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了8個(gè)(CT)n的等位基因．分析表明AC和CT重復(fù)有高相關(guān)性，高AC(＞22．0%)品種具有CT重復(fù)次數(shù)較少(n≤14)的等位基因;相反，除了糯米外，所有低或者中等AC的品種都有CT重復(fù)數(shù)較多(n≥16)的等位基因．本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這22種水稻品種有兩種CT重復(fù)的等位基因:(CT)17和(CT)18，18種水稻是(CT)17，4種水稻是(CT)18．這與Tan等［14］和Bao等［15］報(bào)道大多數(shù)水稻品種具有(CT)17的結(jié)果相符．本研究得到4個(gè)(CT)18水稻品種，“紫香糯861”為糯稻，另3個(gè)常規(guī)粳型水稻是“金豐”、“寶農(nóng)34”和“銀香18”．

陸家安等［16］報(bào)道，“金豐”水稻食味超過(guò)韓國(guó)食味最優(yōu)質(zhì)的“一品稻”，在2000年就被列為上海市優(yōu)質(zhì)米推廣后備品系，參與了上海市政府提出三年優(yōu)質(zhì)米推廣計(jì)劃，成為優(yōu)質(zhì)米的推廣品種之一．江健等報(bào)道，“99-34”(“即寶農(nóng)34”［17］)稻米蒸煮出的米飯軟而油亮，適口性好，可與日本越光大米相媲美，并且從大米的外觀、色澤，米飯的光澤、風(fēng)味、軟硬、粘度等方面對(duì)包括“99-34”(“寶農(nóng)34”)、“銀香18”、“青香軟粳”、“南粳46”、“秀水123”等7種水稻品種的品質(zhì)進(jìn)行打分投票，結(jié)果顯示“99-34”(“寶農(nóng)34”)水稻名列第一，“銀香18”雖然不如“99-34”(“寶農(nóng)34”)，但也比“青香軟粳”、“南粳46”和“秀水123”水稻好［18］．因此，認(rèn)為“寶農(nóng)34”，“金豐”和“銀香18”這3種水稻品種，比本研究選用的其他常規(guī)水稻品種可能具有相對(duì)更好的食味品質(zhì)．據(jù)此推測(cè)，Wx 5′UTR-1216處的(CT)18基因型也可能是使稻米具有相對(duì)更好食味品質(zhì)的重要位點(diǎn)．

軟米的米質(zhì)介于糯性和一般稻米之間，蒸煮的米飯軟而不爛，甜潤(rùn)爽口，膨化性好，富有彈性，冷后變硬和回生程度小，符合廣大人群的需求．經(jīng)檢測(cè)22種水稻中有2種糯稻，20種粳稻，其中“滬嘉香軟”、“青香軟粳”和“1013”水稻與“南粳46”水稻一樣是軟米型粳稻．“南粳46”水稻是江蘇省培育品種［11］，“滬嘉香軟”、“青香軟粳”和“1013”水稻是上海市最近培育的軟米水稻新品系．這表明目前上海市常規(guī)水稻的類型也已經(jīng)較為全面和豐富．

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