蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的應(yīng)用

王瑋鵬 苗芳芳 武丹丹 楊軍 王志鋼

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古呼和浩特市環(huán)境科學(xué)研究所，呼和浩特 010030）

隨著蛋白分離技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究獲得的海量信息，對(duì)蛋白質(zhì)的研究已從蛋白質(zhì)化學(xué)發(fā)展到蛋白質(zhì)組學(xué)的研究階段，并成為21 世紀(jì)生命科學(xué)的重要技術(shù)支撐和戰(zhàn)略前沿。蛋白質(zhì)組學(xué)中的蛋白質(zhì)鑒定、定量以及相互作用的研究已實(shí)現(xiàn)了其對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和相關(guān)通路機(jī)制的研究作出貢獻(xiàn)的早期設(shè)想。新的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在很大程度上推進(jìn)了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的深入，闡明了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是通過(guò)蛋白質(zhì)間相互作用（protein-protein interaction）從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞的機(jī)制。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步確定各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的未知分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)這些通路之間的聯(lián)系（cross-talk）及所構(gòu)成的錯(cuò)綜復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)更深入的認(rèn)識(shí)是目前的研究熱點(diǎn)。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念與技術(shù)

1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的定義

1994 年澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams等在意大利的第一屆Siena會(huì)議上首次提出了蛋白質(zhì)組（Proteome）這個(gè)概念，并最初定義為“一個(gè)基因組所表達(dá)的蛋白質(zhì)”［1］。目前認(rèn)為蛋白質(zhì)組是指一個(gè)基因組所編碼的全部蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)是指利用直接測(cè)定和鑒別蛋白質(zhì)的高通量方法，大規(guī)模研究蛋白質(zhì)組的表達(dá)動(dòng)力學(xué)和蛋白質(zhì)相互作用。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞和組織中全部蛋白質(zhì)的科學(xué)，試圖通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究從細(xì)胞水平及整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律，從而深入認(rèn)識(shí)有機(jī)體的各種生理和病理過(guò)程。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域與技術(shù)

對(duì)蛋白質(zhì)組的功能分析是功能基因組學(xué)的核心。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究一般可以劃分為3個(gè)領(lǐng)域：一是蛋白質(zhì)鑒定和分析；二是不同生長(zhǎng)條件下蛋白質(zhì)的泛蛋白質(zhì)組（proteome-wide）差異顯示；三是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。其運(yùn)用的技術(shù)主要是蛋白質(zhì)分離與鑒定技術(shù)，同時(shí)生物信息學(xué)技術(shù)也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)中不可或缺的部分。

傳統(tǒng)蛋白質(zhì)研究方法的單一應(yīng)用已經(jīng)不能滿足目前對(duì)蛋白質(zhì)組研究的要求，在已有方法的基礎(chǔ)上將其整合與創(chuàng)新，已經(jīng)形成了系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)分離與鑒定、蛋白質(zhì)相互作用與修飾及定量研究技術(shù)。對(duì)蛋白質(zhì)樣品的制備通常從樣品的預(yù)分級(jí)開始。常用的預(yù)分級(jí)方法如二維高效液相色譜、液相等電聚焦及膜電泳，亞細(xì)胞分級(jí)與單細(xì)胞水平樣品制備等，主要用以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測(cè)靈敏度，并且可以針對(duì)某一細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)的分離與鑒定是預(yù)分級(jí)處理后蛋白質(zhì)組學(xué)研究中極為重要的一環(huán)，雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 是 目 前常用的方法，毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）則是經(jīng)典電泳技術(shù)與現(xiàn)代微柱分離技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，具有極高的分辨率，而毛細(xì)管色譜（capillary electro chromatography，CEC）則同時(shí)具有毛細(xì)管電泳的高效分離性和HPLC的高效選擇性。

蛋白質(zhì)鑒定的主要手段之一便是生物質(zhì)譜（Biomass spectrometry，Bio-MS），Bio-MS是通過(guò)制備、分離、檢測(cè)氣相生物大分子來(lái)鑒定化合物的高通量技術(shù)，具有較高特異性與靈敏性。液質(zhì)連用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS） 是 以 液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)分析的綜合技術(shù)，它綜合了液相色譜較寬的分離范圍特性與MS的高選擇性和高靈敏度的特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)很好的鑒定效果。在此基礎(chǔ)上建立的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)則將液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合，檢測(cè)樣品即使在液相色譜難分離的情況下，只要通過(guò)多級(jí)質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行的中性碎片掃描，即可發(fā)現(xiàn)并突出混和物中的目標(biāo)化合物，提供更精確的鑒定效果。此外，近年基體輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（matrixassisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）、Shotgun混 合 蛋 白鑒定技術(shù)及蛋白質(zhì)從頭測(cè)序（De-novo）等技術(shù)在未知樣品分析及翻譯后修飾鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。同時(shí)，蛋白質(zhì)定量技術(shù)近年也逐步發(fā)展起來(lái)，一是基于傳統(tǒng)雙向凝膠電泳及染色基礎(chǔ)上的定量，如雙向熒光差異凝膠電泳（two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，DIGE），通過(guò)三色熒光染料分別對(duì)內(nèi)標(biāo)和生物樣本進(jìn)行標(biāo)記，再通過(guò)圖像分析準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白；另一是基于質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的定量，包括采用差異同位素標(biāo)記的相對(duì)定量技術(shù)，如ICAT（isotope-coded affinity tag）、SILAC（stable isotope labeling with amino acids in cell）和iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）等，以及含有特定同位素的目標(biāo)肽段的絕對(duì)定量技術(shù)。值得注意的是，高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用是與生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展分不開的，蛋白質(zhì)定性與定量測(cè)定結(jié)果的分析依賴于生物信息學(xué)建立起來(lái)的計(jì)算模型和數(shù)據(jù)庫(kù)，尤其是未知蛋白的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)更離不開生物信息學(xué)的支持。

2 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與分子調(diào)控

細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控是一個(gè)受多因素影響的復(fù)雜過(guò)程，它不僅受到時(shí)間和空間的限制，還受到營(yíng)養(yǎng)條件和細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境條件的影響。盡管目前對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)機(jī)制了解得很少，但它已經(jīng)成為了現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的研究重點(diǎn)，同時(shí)也取得了許多重大進(jìn)展。細(xì)胞內(nèi)存在許多不同的信號(hào)通路來(lái)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外刺激所引發(fā)的反應(yīng)，并介導(dǎo)細(xì)胞的代謝、增殖、分化、遷移、周期阻滯或凋亡等生物學(xué)過(guò)程。信號(hào)分子是細(xì)胞的信息載體，種類繁多。信號(hào)分子與靶細(xì)胞表面受體或胞內(nèi)受體的特異性結(jié)合將受體活化后可以啟動(dòng)靶細(xì)胞內(nèi)一條或多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而引發(fā)細(xì)胞代謝或基因表達(dá)的改變，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與分化［2］。

盡管不同的信號(hào)通路具有各自不同的調(diào)節(jié)機(jī)制，但準(zhǔn)確的信號(hào)傳遞則需要各個(gè)通路之間的交叉作用（cross-talk）從而進(jìn)一步形成復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)（intracellular network）。隨著細(xì)胞內(nèi)新的信號(hào)分子的不斷發(fā)現(xiàn)和鑒定，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)愈加復(fù)雜，針對(duì)單一信號(hào)分子的研究技術(shù)和方案已難于滿足對(duì)細(xì)胞生理活動(dòng)的全面了解的需要。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的應(yīng)用為我們揭示了細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，鑒定信號(hào)分子復(fù)合物，探討蛋白質(zhì)間相互作用的分子基礎(chǔ)，新伴侶分子的發(fā)現(xiàn)，以及已知通路之間的交叉和實(shí)現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)態(tài)變化研究提供了重要手段。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的應(yīng)用

3.1 在蛋白質(zhì)之間相互作用中的應(yīng)用

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）和酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白之間相互作用的基本方法。Co-IP是用抗體將相應(yīng)特定分子沉淀的同時(shí)，與該分子特異性結(jié)合的其他分子也會(huì)被帶著一起沉淀出來(lái)的技術(shù)，這種技術(shù)常用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間相互特異性結(jié)合。酵母雙雜交技術(shù)則是在單細(xì)胞真核生物酵母在體內(nèi)利用“誘餌蛋白”（bait）捕獲“獵物蛋白”（prey），二者在細(xì)胞內(nèi)相互作用后形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物從而啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)。此外，融合蛋白沉降技術(shù)與免疫熒光技術(shù)也廣泛適用于蛋白質(zhì)相互作用的研究。pull-down技術(shù)是利用GST對(duì)谷朧甘膚偶聯(lián)球珠的親和性，從非相互作用蛋白的溶液中純化相互作用蛋白，常采用原核表達(dá)純化技術(shù)，適用于體外研究蛋白質(zhì)在溶液中的相互作用。近年單分子操作技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)也有應(yīng)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究的報(bào)道，使得蛋白之間的相互作用檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了直接可測(cè)。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)目前得以廣泛應(yīng)用，可將待檢測(cè)的蛋白混合樣品與結(jié)合到固相基質(zhì)上的蛋白質(zhì)相雜交，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)未知蛋白的分離和鑒定。由于蛋白質(zhì)芯片的高特異性和敏感性，結(jié)合質(zhì)譜、熒光、顯色等方法可以直接或間接地鑒定出與靶蛋白相結(jié)合的蛋白質(zhì)，適用于高通量的蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析。

蛋白質(zhì)復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)行使多種功能。鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合體的亞基是理解蛋白質(zhì)復(fù)合體功能的基礎(chǔ)。Guerrero等［3］發(fā)明了一種體內(nèi)串聯(lián)親和純化交聯(lián)蛋白質(zhì)復(fù)合體的定量分析（quantitative analysis of tandem affinity purified in vivo cross-linked（X）protein complexes，QTAX）技術(shù)來(lái)描述體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用（protein-protein interaction，PPI），并利用這一策略成功繪制了酵母中26S蛋白酶體（細(xì)胞內(nèi)降解蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合體）的相互作用網(wǎng)絡(luò)。26S蛋白質(zhì)復(fù)合體中有64對(duì)潛在的PPI，其中42對(duì)是新發(fā)現(xiàn)的相互作用。

較為復(fù)雜的研究則包括許多非常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)手段。例如，酵母是研究G-蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCR）信號(hào)通路的一種模式生物。GPCR研究為理解絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路包括交配信息素（mating pheromone）的應(yīng)答提供了基礎(chǔ)。Gruhler等使用13C6-Lysine和13C6-Arginine標(biāo)記，對(duì)賴氨酸和精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母交配信息素誘導(dǎo)的磷酸化改變進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，用固定化金屬離子親和層析（immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）富集磷酸化肽段；在離子阱（ion trap）中大量發(fā)生中性丟失的離子可被進(jìn)一步分離、碎裂和分析，這稱為MS/MS/MS（MS3）。準(zhǔn)確的母離子質(zhì)量結(jié)合MS3圖譜信息，可以提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)的磷酸肽鑒定可信度。該研究以混合線性離子阱-傅立葉變換粒子回旋共振（linear ion trap-Fourier transform ion cyclotron resonance，LTQ-FTICR）質(zhì)譜儀進(jìn)行MS/MS和中性丟失導(dǎo)向（neutral lossdirected）的MS3分析，提高對(duì)磷酸肽檢測(cè)及鑒定的靈敏度和準(zhǔn)確性。利用MS/MS掃描自動(dòng)觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴的MS3對(duì)中性丟失的母離子進(jìn)行碎裂，這一中性丟失依賴的MS3運(yùn)行模式會(huì)出現(xiàn)特征性磷酸丟失（-98 Da），通過(guò)2次連續(xù)的串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)磷酸肽進(jìn)行測(cè)序。共鑒定了700個(gè)磷酸肽，其中139個(gè)表達(dá)變化在2倍以上，主要是MAPK信號(hào)通路成員［4］。

3.2 在分子伴侶研究中的應(yīng)用

分子伴侶是存在于細(xì)胞中，幫助蛋白質(zhì)正確折疊使之正常行駛功能的小分子蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要意義。近幾年應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在分子伴侶的相關(guān)研究中取得了較大的進(jìn)展（表 1）。

3.3 在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的關(guān)聯(lián)與機(jī)制研究中的應(yīng)用

細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)是細(xì)胞通過(guò)胞外或胞內(nèi)的刺激后，激活受體而改變細(xì)胞內(nèi)生理機(jī)能的過(guò)程，這種刺激可以是很小的分子、蛋白、甚至是光子，細(xì)胞經(jīng)過(guò)刺激后通過(guò)基因表達(dá)水平的改變對(duì)外界刺激做出回應(yīng)。通過(guò)對(duì)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路分子進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)答過(guò)程不是一條通路的作用結(jié)果，而是不同通路之間交互的調(diào)控作用結(jié)果［11］。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，對(duì)于細(xì)胞通路的交叉作用的研究顯得極為重要。通過(guò)研究不同通路之間的交叉作用，發(fā)現(xiàn)了一些重要通路間的交叉位點(diǎn)（表2）。

4 小結(jié)

雖然蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)給相關(guān)研究帶來(lái)了許多指導(dǎo)性的結(jié)果，但是相關(guān)的技術(shù)仍具有很大的發(fā)展空間。首先是蛋白質(zhì)的分析與鑒定方面，將某個(gè)蛋白質(zhì)組樣品中的所有蛋白質(zhì)分離并檢測(cè)仍然是不現(xiàn)實(shí)的，目標(biāo)蛋白質(zhì)過(guò)低的豐度，特殊的蛋白質(zhì)修飾等都對(duì)此技術(shù)的發(fā)展造成了阻礙。這樣便限制了對(duì)未知的細(xì)胞信號(hào)通路中或已知的通路中未知蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。此外，將一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用組與另一個(gè)相比較幾乎是不可實(shí)現(xiàn)的，兩個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)間的比較仍然沒有很好的方法能夠完成，這限制了信號(hào)通路間交叉作用的研究。倘若這一技術(shù)得到發(fā)展，兩個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)的差異得以方便地確定，則會(huì)大大增進(jìn)通路間交叉作用的新發(fā)現(xiàn)。

表2 應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的重要通路交叉位點(diǎn)及相關(guān)功能

未來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中可能會(huì)更加側(cè)重于生命體依賴的復(fù)合物、通路以及網(wǎng)絡(luò)的形式來(lái)協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)之間的相互作用的研究方向。例如，目前通路間的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)相對(duì)靜態(tài)的連線圖，需要將基因敲除及系統(tǒng)擾動(dòng)等數(shù)據(jù)加入進(jìn)來(lái)，以期認(rèn)識(shí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的本質(zhì)，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的核心。除此之外，如何在不影響細(xì)胞的正常生理?xiàng)l件下的活細(xì)胞分析及檢測(cè)動(dòng)態(tài)的蛋白間相互作用仍然會(huì)是研究的熱點(diǎn)。

［1］ Wilkins MR, Sanchez JC, Gooley AA, et al. Progress with proteome projects：why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it［J］. Biotechnol Genet Eng Rev, 1995,13：19-50.

［2］ Jayaseelan S, Tenenbaum SA. Neurodevelopmental disorders：Signalling pathways of fragile X syndrome［J］. Nature, 2012, 492：359-360.

［3］ Guerrero C, Tagwerker C, Kaiser P, Huang L. An integrated mass spectrometry-based proteomics approach：QTAX to decipher the 26 S proteasome interacting network［J］. Mol Cell Proteomics, 2006, 5：366-378.

［4］ Gruhler A, Olsen JV, Mohammed S, et al. Quantitative phosphorproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway［J］. Mol Cell Proteomics, 2005, 4：310-327.

［5］ Haupt A, Joberty G, Bantscheff M, et al. Hsp90 inhibition differentially destabilises MAP kinase and TGF-beta signalling components in cancer cells revealed by kinase-targeted chemoproteomics［J］.BMC Cancer, 2012, 12：38.

［6］ Moulick K, Ahn JH, Zong H, et al. Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by Hsp90［J］. Nat Chem Biol, 2011, 7：818-826.

［7］ Witt SN. Molecular chaperones, alpha-synuclein, and neurodegeneration［J］. Mol Neurobiol, 2013, 47：552-560.

［8］ Kato Y, Kajiwara C, Ishige I, et al. HSP70 and HSP90 differentially regulate translocation of extracellular antigen to the cytosol for crosspresentation［J］. Autoimmune Dis, 2012：745962.

［9］ Simet SM, Pavlik JA, Sisson JH. Proteomic analysis of bovine axonemes exposed to acute alcohol：role of endothelial nitric oxide synthase and heat shock protein 90 in cilia stimulation［J］.Alcohol Clin Exp Res, 2013, 37（4）：609-615.

［10］ Morgan ED, Eunice HL, Elizabeth AS, et al. Operational plasticity enables Hsp104 to disaggregate diverse amyloid and nonamyloid clients［J］. Cell, 2012, 151：778-793.

［11］ Vert G, Chory J. Crosstalk in cellular signaling：background noise or the real thing?［J］. Dev Cell, 2011, 6：985-991.

［12］ Wang Y, Ding QQ, Yen CJ, et al. The crosstalk of mTOR/S6K1 and Hedgehog pathways［J］. Cancer Cell, 2011, 21 ：374-387.

［13］ Tumaneng K, Schlegelmilch K, Russell RC, et al. YAP mediates crosstalk between the Hippo and PI（3）K-TOR pathways by suppressing PTEN via miR-29［J］. Nature Cell Biology, 2012,14：1322-1329.

［14］ Mendoza MC, Er EE, Blenis J. The Ras-ERK and PI3K-mTOR pathways：cross-talk and compensation［J］. Trends Biochem Sci, 2011, 6：320-328.

［15］ Maniati E, Bossard M, Cook N, et al. Crosstalk between the canonical NF-κB and Notch signaling pathways inhibits Pparγ expression and promotes pancreatic cancer progression in mice［J］. J Clin Invest, 2011, 121：4685-4699.

［16］ Oeckinghaus A, Hayden MS, Ghosh S. Crosstalk in NF-κB signaling pathways［J］. Nature Immunology, 2011, 12 ：695-708.

［17］ Singh AM, Reynolds D, Cliff T, et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells：a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation［J］. Cell Stem Cell, 2012, 3：312-326.

［18］ Hsu JM, Chen CT, Chou CK, et al. Crosstalk between Arg 1175 methylation and Tyr 1173 phosphorylation negatively modulates EGFR-mediated ERK activation［J］. Nature Cell Biology, 2012,13：174-181.