根霉在發(fā)酵工業(yè)與環(huán)境科學中的研究進展

劉金梅 張鳳英

（江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，南昌 330045）

根霉菌屬藻菌綱（Phycomcetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoraceae）、根霉屬（Rhizopus Ehrenberg），根霉種（Rhizopus spp.），是自然界中廣泛存在的一類真菌，千百年來一直是我國數(shù)種傳統(tǒng)發(fā)酵食品的重要發(fā)酵菌［1］。發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用的根霉純種主要是從自然發(fā)酵食品和傳統(tǒng)酒曲中篩選獲得。根霉屬包括米根霉、華根霉和少孢根霉等種。目前中國工業(yè)微生物保藏中心保藏的根霉種主要有14種：雪白根霉（Rhizopus niveus）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）、爪哇根霉（Rhizopus javanicus）、米根霉（Rhizopus oryzae）、 戴 爾 根 霉（Rhizopus delemar）、華根霉（Rhizopus chinensis）及小孢根霉（Rhizopus microsporus）等。其中，米根霉（Rhizopus oryzae）是經(jīng)美國FDA認證的安全菌株，所需營養(yǎng)源簡單，是根霉菌種中被研究最多得菌種之一。根霉的代謝產(chǎn)物如乳酸、富馬酸、L-蘋果酸及消化酶等有重要的經(jīng)濟價值［2-4］，廣泛用于食品、醫(yī)藥及飼料等行業(yè)。由于根霉產(chǎn)糖化酶活力很高，利用根霉制曲釀酒釀醋早已在食品工業(yè)廣泛應(yīng)用，中國是最早利用根霉糖化淀粉（即阿明諾法）生產(chǎn)酒精的國家。目前相關(guān)研究又證明腐乳、醬油、豆醬、豆腐糕、霉豆渣及丹貝等天然發(fā)酵食品中均含有豐富的根霉菌。近年來，國內(nèi)外又有部分專家對根霉菌在環(huán)境科學領(lǐng)域的應(yīng)用展開了研究，并取得了一定的成果。隨著根霉菌特殊代謝產(chǎn)物研究的不斷深入，相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)也越來越受到重視。

1 根霉在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用

1.1 根霉在酸味劑的科研生產(chǎn)中的應(yīng)用

1.1.1 根霉產(chǎn)L-乳酸 L-乳酸是一種非常重要的有機酸，是目前最具發(fā)展前途的有機酸之一，廣泛應(yīng)用于在食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、紡織、皮革等領(lǐng)域。特別是由L-乳酸聚合而成的聚L-乳酸，具有生物降解性和生物相容性，是良好的綠色包裝材料，對減少“白色污染”具有重要的意義［5-7］。

在自然界中，有眾多產(chǎn)有機酸的微生物，但根霉因其營養(yǎng)要求簡單，菌絲體大而易于分離，產(chǎn)酸能力強且產(chǎn)物的光學純度高、易于精制而被普遍應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，成為國內(nèi)外廣范采用的發(fā)酵菌種。根霉產(chǎn)生的淀粉酶及糖化酶，能利用糖、淀粉或淀粉質(zhì)原料生成乳酸。迄今為止，米根霉被認為是最適合生產(chǎn)乳酸的菌種之一。2008年，秦菊霞等［8］以米根霉3038為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變得到1株適合甘蔗糖蜜（干固形物約含40%蔗糖和15%還原糖）發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的突變株，以三步處理后的糖蜜15%為碳源，發(fā)酵4 d的乳酸產(chǎn)量為60.0 g/L；Kelly［9］利用根霉（R. arrhizus）以廢棄的土豆淀粉作為基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，比較不同氮源硫酸銨、硝酸銨、尿素、酵母提取物、蛋白胨及碳氮比對乳酸生成量的影響，試驗表明，較低的碳氮比有助于提高乳酸的產(chǎn)量，較高的碳氮比有助于生產(chǎn)富馬酸，硝酸銨為產(chǎn)乳酸最佳氮源。大量的數(shù)據(jù)分析表明，高濃度的硝酸銨有助于提高乳酸的產(chǎn)量，乳酸的最高產(chǎn)量為36.4 g/L，轉(zhuǎn)化率達到了91%。Chotisubha-anandha等［10］以固定床生物反應(yīng)器固定化米根霉產(chǎn)乳酸，試驗結(jié)果表明，當生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速和通氣比為700 r/min和0.5 vvm，葡萄糖濃度為70 g/L時，乳酸產(chǎn)率最高達2.09 g/L·h，最終濃度為37.83 g/L。

1.1.2 根霉產(chǎn)富馬酸 富馬酸是一種含雙鍵的二元羧酸，作為重要的有機化工原料和精細化工產(chǎn)品，在材料（樹脂、涂料及增塑劑等）、醫(yī)藥、化工、食品及飼料添加劑等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。同時，富馬酸可作為合成多種高價衍生物的原料，如富馬酸亞鐵、富馬酸二甲酯等。另外，富馬酸還是一種重要的四碳平臺化合物，通過酶催化轉(zhuǎn)化、酯化、加氫等工藝，可用來生產(chǎn)L-天冬氨酸、琥珀酸、蘋果酸、1，4-丁二醇、四氫呋喃等四碳化合物，因此被美國能源部列為優(yōu)先發(fā)展的12種平臺化合物之一。富馬酸主要是以葡萄糖為原料，利用根霉等絲狀真菌經(jīng)耗氧發(fā)酵產(chǎn)生的。當前生產(chǎn)富馬酸法主要有順酐（又稱馬來酸酐）異構(gòu)法、糠醛氧化法、馬來酸酶催化異構(gòu)法、石蠟發(fā)酵法等，工業(yè)上主要采用順酐異構(gòu)法，因為其他方法采用的原料均為石油基產(chǎn)品，而石油資源供應(yīng)日趨緊張，故而產(chǎn)品的市場競爭力逐漸下降。

因根霉菌（Rhizopus sp.）產(chǎn)富馬酸能力較強，且具有營養(yǎng)需求簡單、生長迅速及環(huán)境適應(yīng)能力強等優(yōu)點，從而成為重點研究對象。據(jù)目前所報道的文獻來看，米根霉和少根根霉是研究以碳水化合物或其他可再生物質(zhì)為原料生產(chǎn)富馬酸工藝中使用最多的菌種，其中米根霉是目前已報道文獻中生產(chǎn)強度最高的菌種，而少根根霉是產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率最高的菌種。早在1989年，Kautola和Linko［11］用固定化少根根霉TKK 204-1-1a生產(chǎn)富馬酸，通過統(tǒng)計試驗設(shè)計和經(jīng)驗建模進行分批發(fā)酵的優(yōu)化設(shè)計，在木糖濃度為6%，碳氮比為160∶1時富馬酸的濃度達到最高。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵時間為1.75 d時，達到最高體積產(chǎn)率為每小時87 mg/L；發(fā)酵時間為10.25 d時，最高產(chǎn)物濃度達16.4 g/L。劉寧等［12］探討了不同濃度的初始葡萄糖以及有機氮源酵母膏和無機氮源（NH）2SO4對少根根霉合成富馬酸的影響。并以此為基礎(chǔ)采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化了富馬酸的產(chǎn)量以及其轉(zhuǎn)化率。研究結(jié)果表明，當葡萄糖和（NH）2SO4的濃度分別為121.2 g/L、2.23 g/L時，富馬酸的最大轉(zhuǎn)化率為55.16%，當葡萄糖和（NH）2SO4的濃度分別為162.0 g/L、3.0 g/L時，富馬酸的最大產(chǎn)量為75.15 g/L，相比優(yōu)化前的結(jié)果，富馬酸產(chǎn)量得到明顯提高。

南京工業(yè)大學制藥與生命科學學院張昆等利用Modeller7v7軟件對米根霉富馬酸酶（fumarase）進行了三級結(jié)構(gòu)的同源建模，并驗證了結(jié)果在空間和能量上的合理性，進一步對酶的結(jié)構(gòu)域和催化活性位點進行了研究。結(jié)果表明，富馬酸酶由3個結(jié)構(gòu)域組成，中心區(qū)域為一個由5個幾乎平行的α-螺旋組成的獨特的束型結(jié)構(gòu)，其催化活性位點是由3個亞基上的氨基酸相互靠近共同組成的［13］。為有針對性的進行富馬酸酶的定點突變提高富馬酸產(chǎn)量提供分子水平上的理論指導(dǎo)。

1.1.3 根霉產(chǎn)L-蘋果酸 L-蘋果酸主要作為酸味劑和保鮮劑用于食品工業(yè)，是繼檸檬酸、乳酸之后的世界第三大酸味添加劑，亦是目前世界食品工業(yè)中用量最大和發(fā)展前景較好的有機酸之一。由于其口感接近天然果汁并具有天然香味，且較之于檸檬酸，L-蘋果酸產(chǎn)生的熱量及其刺激性更低，口味更好。因此廣泛應(yīng)用于酒類、飲料、果醬、口香糖等多種食品中，未來可能具有逐漸代替檸檬酸的趨勢。此外，L-蘋果酸還具有一定的生理功能，在醫(yī)藥及保健品等領(lǐng)域也有重要應(yīng)用。

能直接利用糖質(zhì)原料一步發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的微生物有黃曲霉和根霉，但黃曲霉因其次生代謝產(chǎn)物中可能存在對人體及動物有致癌作用的黃曲霉毒素而倍受爭議。而根霉所產(chǎn)的L-蘋果酸通常是其生產(chǎn)L-乳酸和富馬酸過程中的一種中間代謝產(chǎn)物，一般需通過改變其傳統(tǒng)代謝途徑，才能達到累積的目的。研究發(fā)現(xiàn)，米根霉積累富馬酸的代謝途徑與黃曲霉積累L-蘋果酸的途徑類似。田三德等［14］采用華根霉和畢赤酵母菌株混合培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果，分別從葡萄糖濃度、華根霉接種量、混合培養(yǎng)方式及聚乙二醇添加量4個方面探討了其對發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果的影響，通過正交試驗確定其優(yōu)化組合，在優(yōu)化條件下，L-蘋果酸產(chǎn)量達78.9 g/L，對投糖濃度的摩爾轉(zhuǎn)化率為87.4%。何皓等［15］考察了富馬酸酶活抑制劑放線菌酮對米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸和富馬酸的影響。結(jié)果表明，發(fā)酵16 h加入濃度15 mg/L的放線菌酮使米根霉富馬酸酶胞質(zhì)同功酶比活力峰值降低48.7%，而蘋果酸脫氫酶胞質(zhì)同功酶活力卻未有明顯改變，生成的富馬酸比對照樣減少37.1%，而L-蘋果酸積累量提高54.6%，達到21.7 g/L。表明通過對米根霉富馬酸酶胞質(zhì)同功酶的抑制作用能減弱米根霉積累富馬酸代謝途徑中由L-蘋果酸向富馬酸的轉(zhuǎn)化，從而促進米根霉積累L-蘋果酸。

1.2 根霉在生物酶發(fā)酵中的應(yīng)用

1.2.1 根霉產(chǎn)糖化酶 根霉在發(fā)酵代謝過程中能產(chǎn)生多種淀粉酶，包括α-淀粉酶（α-amylase，EC3.2.1.1），也叫液化酶；β-淀粉酶（β-amylase，EC3.2.1.2）；葡萄糖淀粉酶（Glucoa-Mylase，EC3.2.1.3），也叫 γ-淀粉酶，簡稱糖化酶（縮寫GA 或G）；異淀粉酶（isoamylase，EC3.2.1.68，糖原6-葡聚糖水解酶）等。其中糖化酶可以迅速的從淀粉的非還原性末端將淀粉水解，釋放出葡萄糖，并像β-淀粉酶一樣，使水解下來的葡萄糖發(fā)生構(gòu)型變化，形成β-D-葡萄糖。它也可以微弱的水解α-1，6糖苷鍵和α-1，3連接的碳鏈，它一般都能將淀粉百分之百地水解生成葡萄糖，因此被廣泛地應(yīng)用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有機酸、甘油和淀粉糖等工業(yè)生產(chǎn)中，是我國產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品［16］。最早在全國釀酒行業(yè)推廣應(yīng)用，被公認為性能優(yōu)良的釀酒用根霉糖化菌Q303是由貴州省輕工業(yè)研究所于1977年分離。該菌種主要糖化力強、適應(yīng)性強、性能穩(wěn)定，可用于不同原料釀造小曲酒、甜酒釀、黃酒的生產(chǎn)，是我國應(yīng)用最廣的根霉糖化菌。但Q303也有缺陷：Q303在培菌過程中會在米粉基質(zhì)表面產(chǎn)生大量的黑孢子，從而使做出的酒餅丸表面易發(fā)黑，為消費者所不能接受，所以Q303不太適合用于做米粉曲（酒餅丸），更適合做麩皮散曲。針對Q303的缺點，于博和馬蕤等［17，18］自2000年以來成功分離2株米根霉菌株（R. oryzae F6和R. oryzae F14），糖化酶活力高，在繁殖過程中產(chǎn)生的黑孢子較少、顏色也較淺，一般在生產(chǎn)基質(zhì)上不會呈現(xiàn)肉眼可見黑孢子，而且釀造的酒的風味獨特。現(xiàn)已在多個酒曲廠推廣應(yīng)用。王旭亮等［19］以不同香型大曲為篩選源分離得到96株霉菌，經(jīng)過系列工藝過程，篩選出一株優(yōu)勢霉菌，其純種曲糖化力、發(fā)酵結(jié)束后培養(yǎng)基中酒精濃度、出酒率分別為2 657.00 U/g、15.40 mL/100 g、42.73%，經(jīng)鑒定后該優(yōu)勢菌確定為米根霉。甜酒曲中的糖化菌種主要是以米根霉為主。

1.2.2 根霉產(chǎn)脂肪酶 微生物因具有產(chǎn)脂肪酶種類多，成本低，產(chǎn)量高等優(yōu)點而成為脂肪酶的重要來源［20］。脂肪酶可以用來催化酯類化合物的水解、酯化、醇解、酯交換及合成等，反應(yīng)無需輔酶、能耗低、條件溫和、底物原料品質(zhì)要求低、副產(chǎn)物少，主要用于食品加工、生物柴油制備、手性藥物拆分、生物傳感器（酶傳感器）等領(lǐng)域。根霉是脂肪酶的重要生產(chǎn)菌，且根霉脂肪酶多具有高度的1、3位置專一性，可優(yōu)先水解飽和脂肪酸鏈（C8-C18），根霉該特性使其在含油脂食品的增香、芳香酯及其他酯類的合成以及某些手性化合物的拆分等方面受到廣泛關(guān)注。

根霉在產(chǎn)脂肪酶方面的研究大多集中在誘變選育及發(fā)酵條件優(yōu)化等方面。如孫春艷等［21］采用紫外線、硫酸二乙酯及兩者的復(fù)合對實驗室保藏的1株高產(chǎn)耐熱脂肪酶的根霉SFE-L01菌株進行誘變處理，篩選獲得1株突變株UD-23，產(chǎn)耐熱脂肪酶活力比出發(fā)菌株提高了112.39%，達24 000.00 U/mL。冀頤之等［22］通過單因子和正交試驗，對無載體固定化少根根霉N-103產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進行研究。在優(yōu)化條件下，少根根霉脂肪酶酶活可達100 U/mL，為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方對照組的1.33倍。魏濤等［23］對根霉zz-3脂肪酶的產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化并對其脂肪酶酶學性質(zhì)進行了研究。結(jié)果顯示，250 mL三角瓶液體培養(yǎng)，裝液量100 mL，該根霉產(chǎn)脂肪酶的最佳培養(yǎng)基為：黃豆粉3 g/100 mL，（NH4）2SO40.3g/100 mL，MgSO40.2 g/100 mL，K2HPO40.2 g/100 mL，花生油0.3 g/100 mL，pH自然。在溫度28℃、轉(zhuǎn)速150 r/min，搖床培養(yǎng)2 d，發(fā)酵酶活力達124.60 U/mL。該酶酶學性質(zhì)的初步研究結(jié)果為：最適反應(yīng)溫度為37℃，最適為pH7.5，在溫度低于40℃、pH7-9條件下酶活穩(wěn)定。冀頤之等［24］采用低能N+離子注入技術(shù)，對少根根霉BUCT-11進行誘變選育，以達到提高脂肪酶產(chǎn)量的效果。試驗結(jié)果表明：經(jīng)誘變后，篩選得到高產(chǎn)脂肪酶突變菌株N103，經(jīng)搖瓶發(fā)酵，測得脂肪酶水解酶活力為175 U/mL，是出發(fā)菌株產(chǎn)量的165%，且其遺傳穩(wěn)定性較好。

綜上所述，現(xiàn)有研究均是從誘變育種和環(huán)境因子（pH值、接種量及培養(yǎng)基成分等）對根霉生產(chǎn)代謝各種有機酸和生物酶的影響，從而優(yōu)化根霉發(fā)酵生產(chǎn)工藝。鮮有從基因水平探索根霉菌種與其次級代謝產(chǎn)物之間的內(nèi)在關(guān)系。

1.3 根霉在大豆發(fā)酵食品中的應(yīng)用

1.3.1 根霉在丹貝中的應(yīng)用 丹貝又名天培，是一種以大豆為原料，經(jīng)根霉發(fā)酵后制成的發(fā)酵食品，起源于印度尼西亞，在泰國、馬來西亞等東南亞國家被廣泛使用，是世界上唯一作為主食的大豆發(fā)酵食品。丹貝中的微生物是以根霉為主，另有革蘭氏陰性桿菌及芽孢桿菌。早在1963年，Hesseltine等［25］在丹貝中收集和分離得到40株根霉，主要以少孢根霉為主，另有葡枝根霉、少根根霉、米根霉等共6種根霉，且這些根霉均可用純培養(yǎng)方法制成丹貝。魯菲等［26］對從源于印度尼西亞的丹貝中分離出的一株優(yōu)勢霉菌進行了鑒定，確定其為米根霉種。劉全德等［27］用少孢根霉、乳酸菌及甜酒曲共同發(fā)酵大豆基質(zhì)制作丹貝，該丹貝氨基酸含量等營養(yǎng)成分趨于平衡，營養(yǎng)和風味明顯改善。

1.3.2 根霉在腐乳中的應(yīng)用 豆腐乳是一種具我國民族特色的釀造食品，具有獨特鮮美的味道、價格便宜、營養(yǎng)豐富，備受人們喜愛。豆腐乳在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生蛋白酶，催化變性后的蛋白質(zhì)水解成多種游離氨基酸，以及水溶性多肽等功能性成分，具有廣闊的開發(fā)前景。根霉菌是發(fā)酵產(chǎn)腐乳的主要菌種之一，譚平等［28］對津市地方風味腐乳中的菌種進行分離與擴大培養(yǎng)，在無雜菌污染的情況下分別采用了固體擴大培養(yǎng)及液體擴大培養(yǎng)兩種方法，結(jié)果分離出3株毛霉，2株根霉。秦恩華等［29］對根霉發(fā)酵豆腐乳過程中游離氨基酸和可溶性蛋白酶進行了檢測，結(jié)果表明，兩者的動態(tài)變化不穩(wěn)，前者總體呈下降趨勢，后者總體呈上升趨勢，分別在20 h和24 h達到最大值。張斌等［30］利用魯氏毛霉和米根霉兩株優(yōu)勢菌，在最優(yōu)條件發(fā)酵得到的成品腐乳具有整齊的塊形、乳黃色的色澤，具備優(yōu)品腐乳的特性。

1.3.3 根霉在醬油中的應(yīng)用 醬油制造主要是利用微生物酶的催化作用。制曲是醬油發(fā)酵非常重要的一環(huán)，微生物在原料上代謝生長，產(chǎn)生大量的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等酶類，以備后期發(fā)酵所用，其中蛋白酶尤為重要，它能影響原料蛋白利用率和終產(chǎn)品的風味。根霉并不是生產(chǎn)醬油的最優(yōu)勢菌群，但多菌種發(fā)酵制備醬油是醬油釀造行業(yè)的一項先進技術(shù)。靳文生［31］用米曲霉3.042、黑曲霉3.350、根霉3.010三種霉菌以3∶2∶0.5比例在36℃進行混合制曲48 h，此曲酶系豐富，酶活力高，其中蛋白酶、淀粉酶、纖維酶分別達到3 830 U/g、630 U/g、1 800 U/g。顧立眾［32］以豆粕和小麥為主要原料，采用固態(tài)低鹽原池淋澆發(fā)酵法生產(chǎn)基礎(chǔ)醬油，對基礎(chǔ)醬油使用根霉酯化酶進行增香，試驗結(jié)果表明：添加根霉酯化酶能顯著提高基礎(chǔ)醬油中揮發(fā)酯的含量，使醬油滋味醇厚，香氣濃郁。蔣予箭等［33］對母子醬油發(fā)酵醬醅中霉菌的菌相組成進行了分析，結(jié)果表明，母子醬油發(fā)酵醬醅中米曲霉占優(yōu)勢菌群，另有根霉、黑曲霉、毛霉、青霉和葡萄孢霉。

2 根霉在環(huán)境科學的應(yīng)用及其在食品工業(yè)中的安全性

2.1 廢物利用方面的應(yīng)用

近幾年研究表明根霉在廢物再利用上也充當重要的角色。López等［34］用固定化米根霉發(fā)酵四種食品加工廢物大麥麩皮、米糠以及花生和核桃廢物生產(chǎn)脂肪酸，結(jié)果表明大麥麩皮因具足夠的物理完整性，以及工藝成本低的特點而成為最佳選擇。Balasubramaniam等［35］利用固定化米根霉262全細胞脂肪酶和商業(yè)化純脂肪酶發(fā)酵地溝油（葵花籽油）產(chǎn)脂肪酸烷基酯，結(jié)果顯示，全細胞生物催化劑和純脂肪酶將甘油三酸酯轉(zhuǎn)化為脂肪酸烷基酯的轉(zhuǎn)換率分別達到84%和94%。滕云等［36］用華根霉Y92-M全細胞脂肪酶在無機溶劑體系中催化地溝油合成生物柴油，轉(zhuǎn)化地溝油的轉(zhuǎn)化率高達80%。

2.2 在餐飲及造紙廢水方面的應(yīng)用

利用微生物有效解決環(huán)境上的問題已成為眾學者的一個重要研究方向。人們對根霉在這方面的研究雖不夠深入，但已取得初步成效。目前，我國大多數(shù)餐飲廢水未經(jīng)處理直接排放倒水里，給環(huán)境造成嚴重的污染。吳福安等［37］用米根霉TY GFI菌株降解大豆油脂廢水，其最高降解率達95.6%，這對環(huán)境凈化和水循環(huán)利用具有十分重要的意義。此外，我國造紙廢水產(chǎn)生的活性污泥的無害化處理與處置已成為亟待解決的環(huán)境問題。張建云等［38］用根霉對造紙廢水產(chǎn)生的二級生化處理污泥發(fā)酵產(chǎn)乳酸，優(yōu)化條件下，乳酸最高產(chǎn)量達3.1 g/L；張亞娟［39］用黑根霉菌對Cd2+、Cr6+、Pb2+等重金屬離子進行吸附試驗，結(jié)果表明，黑根霉菌的吸附過程符合Langmuir 吸附模式，對Cd2+、Cr6+、Pb2+具有較高吸附能力，通過Langmuir公式得出Cd2+、Cr6+、Pb2+的Qmax（最大吸附量）分別為52 mg/g、14 mg/g和37.3 mg/g。

2.3 在食品工業(yè)中的安全性問題

在食品工業(yè)中，工業(yè)用菌不僅要考慮其優(yōu)良的生產(chǎn)特性，其安全性也至關(guān)重要。但目前國內(nèi)外對根霉的研究多集中在其工藝條件的優(yōu)化及其發(fā)酵產(chǎn)物在工業(yè)上的應(yīng)用。國內(nèi)對根霉菌安全性問題的研究極少，僅王立群、董明盛等［40，41］采用動物毒理試驗對丹貝的安全性進行了檢測。結(jié)果表明，急性經(jīng)口試驗LD50>15.0 g/kg體重；精母細胞染色體畸變試驗、微核試驗、精子畸形試驗和Ames試驗均為陰性，鉛、砷、ABF1含量均在安全標準以下，證明丹貝是安全食品。

然而，國外有報道用從丹貝中分離的根霉菌發(fā)酵制作丹貝時產(chǎn)生了毒素［42］。據(jù)相關(guān)報道，從根霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的rhizonins 和rhizoxins 可能會造成食品安全問題，它們是兩類在結(jié)構(gòu)上相似的系列化學物質(zhì)。但有研究表明，rhizonins并不是由根霉菌代謝產(chǎn)生的，而是根霉菌中的內(nèi)共生菌產(chǎn)生的［43］。rhizonins是從霉爛的花生中分離出來的一株小孢根霉（R.mcrosporus），是由Steyn等［44］發(fā)現(xiàn)于南非莫桑比克，也是最早報道的從接合菌中分離得到的毒素。在經(jīng)過質(zhì)譜、核磁共振光譜、氨基酸分析和X晶體衍射等的分析后，得出rhizonins是由7個稀有氨基酸構(gòu)成的環(huán)肽化合物，因其有一基團不同而分為rhizonins A和rhizonins B兩種。可能由于rhizonins A是其中主要產(chǎn)物，所以之后的一些研究多集中于rhizonins A。近幾年國內(nèi)外專家對rhizonins A的研究較少。Nakatsuka等［45］對其構(gòu)效關(guān)系進行的研究表明，呋喃結(jié)構(gòu)可能是rhizonins A對脂肪細胞存在潛在毒性的原因。動物試驗結(jié)果表明，rhizonins A及其產(chǎn)生菌均具肝毒性，可導(dǎo)致急性或慢性的肝衰竭而致死。Wilson等［46］在日齡還未能分辨雌雄的北京雛鴨飼料中分別添加由25種根霉和毛霉發(fā)酵的玉米培養(yǎng)物，添加量均為50%（W/W），結(jié)果導(dǎo)致了鴨的死亡；將其中一株小孢根霉菌用于產(chǎn)rhizonins A，并將所產(chǎn)的rhizonins A經(jīng)純化后灌胃部分自交系雄性小白鼠，結(jié)果表明，LD100小于70 mg/kg。經(jīng)光學顯微鏡觀察評估，飼喂玉米培養(yǎng)物的小鼠的肝臟和腎臟病變狀況與灌胃rhizonins A的鼠相似，肝細胞表現(xiàn)出變性到壞死等程度不一的變化，肝組織結(jié)構(gòu)解離，并向匯管區(qū)擴散。

Rhizoxins是從根霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離的另一種次級代謝產(chǎn)物。Iwasaki等［47］首先從華根霉（R.chinensis）培養(yǎng)物中分離純化得到毒性代謝產(chǎn)物，將其命名為rhizoxins（1），并利用紫外、紅外、質(zhì)譜及核磁共振等技術(shù)研究了其分子結(jié)構(gòu)，推斷出其基本結(jié)構(gòu)。Taakahshi和Jian等［48，49］的研究結(jié)果表明，rhizoxins是一類大環(huán)內(nèi)酯化合物，是由16個原子組成的大環(huán)結(jié)構(gòu)、環(huán)氧結(jié)構(gòu)、內(nèi)酯結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。該類化合物中的8種結(jié)構(gòu)類似物的主要不同點在于其2 個環(huán)氧結(jié)構(gòu)的位置和17位碳原子上的取代基團。生物學研究表明，rhizoxins有明顯細胞毒性。Kiyoto和Tsuruo等［50，51］用動物毒理試驗對rhizoxins的毒性進行了檢驗，結(jié)果表明：對小鼠腹腔注射LD502.5 mg/kg，靜脈注射的LD50為5-10 mg/kg，毒性表現(xiàn)為體重減輕或生長遲緩、飲水或攝食減少、腹瀉、輕度白細胞和血小板減少、后肢麻痹等。

由此可見，根霉菌在食品中是一種益、害兼有的真菌，可是目前國內(nèi)在食品工業(yè)應(yīng)用中卻極少關(guān)注其潛在危害。從上可知根霉菌的某些種（報道的有小孢根霉、 華根霉和米根霉等）的發(fā)酵產(chǎn)物中有rhizonins 和 rhizoxins。根霉菌種在腐乳或丹貝的前發(fā)酵時期能在基質(zhì)上產(chǎn)生rhizoxins，可能會帶來食品安全問題。因此，要加強對根霉菌種代謝產(chǎn)物中的rhizonins 和 rhizoxins 的分析研究工作，應(yīng)該重新審視我國以根霉菌為優(yōu)勢菌群的自然發(fā)酵和純種發(fā)酵食品的安全性。

3 結(jié)語

根霉菌是應(yīng)用非常廣泛的工業(yè)用菌，目前我國對根霉的研究工作多集中于優(yōu)良菌株的分離選育及改善環(huán)境條件提高根霉有益代謝產(chǎn)物量方面。未對我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品和傳統(tǒng)發(fā)酵曲中根霉種質(zhì)資源進行過系統(tǒng)調(diào)查，對其代謝產(chǎn)物的研究也欠深入，尤其是有毒代謝產(chǎn)物分析。因此對根霉的研究方向：一方面，探尋潛在的不產(chǎn)毒素，產(chǎn)糖化酶、脂肪酶、L-乳酸、L-蘋果酸、富馬酸等代謝產(chǎn)物的優(yōu)質(zhì)根霉菌種；另一方面，著重比對發(fā)酵產(chǎn)物和不同根霉種間基因差異，建立根霉基因與代謝產(chǎn)物之間關(guān)聯(lián)，為根霉基因育種提供有價值的依據(jù)。

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