口服鹽酸法舒地爾治療小鼠EAE有效性初探*

張 輝， 張海飛， 李艷花， 劉春云， 尉杰忠， 丁智斌， 楊興旺，， 楊琬芳， 李俊蓮， 馮前進(jìn)， 豐 玲， 肖保國(guó)，4， 馬存根， △

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，山西 太原 030001； 2山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 037009；3大同市第五人民醫(yī)院神經(jīng)科，山西 大同 037009； 4復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025；5山西中醫(yī)學(xué)院第三中醫(yī)院腦病科，衛(wèi)生部國(guó)家臨床重點(diǎn)?？?，山西 太原 030024)

口服鹽酸法舒地爾治療小鼠EAE有效性初探*

張 輝1,2， 張海飛2，3， 李艷花2， 劉春云2， 尉杰忠2， 丁智斌1,2， 楊興旺2，5， 楊琬芳5， 李俊蓮5， 馮前進(jìn)5， 豐 玲2， 肖保國(guó)2，4， 馬存根1,2，5 △

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，山西 太原 030001；2山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 037009；3大同市第五人民醫(yī)院神經(jīng)科，山西 大同 037009；4復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025；5山西中醫(yī)學(xué)院第三中醫(yī)院腦病科，衛(wèi)生部國(guó)家臨床重點(diǎn)?？?，山西 太原 030024)

目的探討鹽酸法舒地爾口服對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性脊髓炎(EAE)的治療效果及機(jī)制。方法采用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白33-35肽(MOG35-55)免疫雌性C57BL/6小鼠建立慢性EAE模型，隨機(jī)分為EAE模型組和法舒地爾治療組。免疫后第3天，對(duì)照組予以灌胃生理鹽水，治療組予以法舒地爾，每天1次至免疫后第27天。比較2組小鼠體重變化和臨床評(píng)分。第28天處死動(dòng)物，脊髓冰凍切片進(jìn)行髓鞘染色和HE染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞M1型和M2型巨噬細(xì)胞的表型， ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液白細(xì)胞介素 10(IL-10)、白細(xì)胞介素 1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的釋放。結(jié)果法舒地爾口服推遲EAE發(fā)病時(shí)間，減緩EAE癥狀，減少體重下降，減少EAE髓鞘脫失和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥浸潤(rùn)，抑制M1型巨噬細(xì)胞CD16/32表達(dá)，增加M2型巨噬細(xì)胞CD206和IL-10表達(dá)，同時(shí)抑制炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的釋放。結(jié)論法舒地爾口服具有良好的治療效果，可明顯減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘脫失和炎癥病灶。其作用機(jī)制可能使M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，從而抑制炎癥細(xì)胞因子釋放。

法舒地爾； 口服； 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性脊髓炎； 巨噬細(xì)胞； 細(xì)胞因子類

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥脫髓鞘性自身免疫性疾病，其病理特征是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫而引起髓鞘脫失和軸突損害，具有高致殘率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)。MS的治療主要采用皮下或肌內(nèi)注射類固醇藥物和干擾素β(interferon β, IFN-β)等方法，但給藥途徑繁瑣、副作用大、患者依從性差和費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)與MS在臨床和病理機(jī)制等方面有很多相同和相似之處[1]，是研究MS的理想動(dòng)物模型。Rho/Rho相關(guān)激酶(Rho-associa-ted kinase, ROCK)信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)普遍存在的一種信號(hào)通路，主要參與血管收縮、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)。近年的研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如MS和帕金森病(Parkinson disease, PD)等病理過(guò)程中，ROCK的異常激活發(fā)揮著重要作用。鹽酸法舒地爾(fasudil)是臨床和科研上常用的ROCK抑制劑，我們前期的研究證實(shí)腹腔注射具有良好的治療EAE的作用[2]。但是MS作為一個(gè)復(fù)發(fā)緩解的慢性疾病，長(zhǎng)期采用靜脈給藥顯然存在很大的局限性。因此，本研究目的是探討法舒地爾口服途徑治療EAE的有效性，并探討其作用機(jī)制，為今后臨床使用法舒地爾口服治療MS等神經(jīng)炎癥或變形疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物和材料

雌性C57BL/6小鼠14只，8～10周齡，體重18～20 g，購(gòu)自北京維通利華公司。小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide, MOG35-55)由西安聯(lián)美生物科技有限公司合成；完全福氏佐劑購(gòu)自Sigma；結(jié)核分枝桿菌(tuberculosis bacilli,TB)H37Ra購(gòu)自BD；百日咳毒素(pertussis toxin, PTX)購(gòu)自ENZO；白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-10和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)測(cè)定ELISA試劑盒購(gòu)自Peprotech。流式細(xì)胞儀為BD FACS Calibur產(chǎn)品。流式抗體購(gòu)自Becton Dickinson。

2主要方法

2.1EAE模型制備及法舒地爾處理

2.1.1EAE模型制備 C57BL/6雌性小鼠實(shí)驗(yàn)前在無(wú)病源菌實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周后，按平均體重隨機(jī)分為EAE對(duì)照組(n=7)和法舒地爾治療組(n=7)。將3.5 mg MOG35-55溶解于0.7 mL生理鹽水，4.2 mg TB溶解于0.7 mL完全福氏佐劑，兩者混合，用針管混合器推成油包水樣乳劑，乳劑靜置后無(wú)擴(kuò)散即為合格。小鼠用乙醚麻醉后，于小鼠脊柱兩側(cè)分4點(diǎn)皮下注射，每只0.1 mL。于免疫當(dāng)天和48 h后，腹腔分別注射PTX(每只0.75 mg)以加強(qiáng)動(dòng)物免疫反應(yīng)。

2.1.2法舒地爾處理 鼠免疫后第3天開(kāi)始灌胃(生理鹽水每天每只200 μL， 法舒地爾每天每只1 mg/200 μL)，持續(xù)給藥至免疫后27 d。自免疫當(dāng)天開(kāi)始每天觀察小鼠臨床評(píng)分并記錄其體重變化。臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采取國(guó)際通用的5分法：0分，無(wú)任何臨床癥狀；1分,尾部張力消失，可見(jiàn)輕度步態(tài)笨拙；2分，一側(cè)后下肢無(wú)力，被動(dòng)翻身可以恢復(fù)；3分，雙后肢癱瘓，被動(dòng)翻身不能恢復(fù)，但予以刺激可以挪動(dòng)；4分，雙后肢癱瘓伴前肢癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或死亡。評(píng)分介于兩者之間者以±0.5分計(jì)。累積臨床評(píng)分[3]為自小鼠發(fā)病當(dāng)天起(疾病評(píng)分≥1)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束評(píng)分的總和。累積疾病指數(shù)[4]計(jì)算方法為累積疾病指數(shù)為組內(nèi)每只小鼠每天臨床評(píng)分總和的均數(shù)。

2.2標(biāo)本采集 于免疫后28 d，采用0.3%戊巴比妥鈉麻醉后取脾臟，制備成單個(gè)核細(xì)胞懸液。同時(shí)，動(dòng)物用生理鹽水灌注，再用4%多聚甲醛行組織固定，分離脊髓，OCT(optimal cutting temperature)包埋劑包埋，于液氮中冷凍，做冰凍切片，厚度為10 μm， 行髓鞘染色和HE染色。

2.3HE染色 將切片水中浸泡2 min,蘇木精染色4 min,快速水洗，0.5%鹽酸乙醇分化15 s，0.5%伊紅30 s, 快速水洗,梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。

2.4髓鞘染色 取切片于70%乙醇中浸泡15 min，浸于固藍(lán)液中，57℃孵育24 h，于95%乙醇溶液浸洗10 min，去離子水浸洗5 min，0.05%碳酸鋰快速浸洗10 s，70%乙醇分化至灰質(zhì)與白質(zhì)能夠清晰辨別，去離子水浸洗5 min，梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 小鼠脾細(xì)胞懸于50 μL 0.1%皂苷(saponin)/1%BSA-PBS破膜劑或1%BSA-PBS緩沖液中，分別加1 μL流式抗體，包括Flour-488-CD11b、PE-IL-10、PE-CD16/32和PE-CD206抗體，室溫避光20 min。PBS洗2次，各加500 μL PBS，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.6ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-10和TNF-α 小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集上清液置-80 ℃待檢測(cè)。IL-1β、IL-10和TNF-α的濃度采用商業(yè)ELISA試劑盒，具體檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。參考各因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，結(jié)果以ng/L表示。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，采用GraphPad Prism 5.0軟件分析，組間比較采用t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1法舒地爾口服對(duì)EAE小鼠的療效比較

EAE小鼠于免疫后第10天到第14天陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)為精神萎靡、食欲減少、皮毛不光滑和體重減輕等，直至發(fā)生肢體癱瘓，最高分達(dá)4.5分，平均發(fā)病天數(shù)為免疫后第(12.75±2.25)天，而法舒地爾治療組平均發(fā)病天數(shù)為免疫后第(15.57±2.82)天，與EAE對(duì)照組平均發(fā)病天數(shù)相比明顯推遲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EAE對(duì)照組平均高峰期評(píng)分為2.75±1.00，而法舒地爾治療組為1.43±0.45，與EAE對(duì)照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。EAE對(duì)照組累積臨床評(píng)分為28.63±11.09，而法舒地爾治療組累積臨床評(píng)分為12.71±4.92，較EAE對(duì)照組明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。EAE對(duì)照組累積疾病指數(shù)為1.56±0.56，而法舒地爾治療組累積疾病指數(shù)為0.71±0.24，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1A。EAE對(duì)照組臨床癥狀的加重可伴體重減輕，法舒地爾治療小鼠可明顯減緩體重的減輕(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖1B。

Figure 1. The incidence of the mice in EAE group and fasudil intervention group. A: clinical score; B: body weight. The comparison in each time point was separately analyzed by Mann-WhitneyUtest.Mean±SD.n=7.*P<0.05,**P<0.01vsEAE group.

圖1EAE組和法舒地爾組發(fā)病情況

2法舒地爾口服減少EAE中樞炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘的脫失

HE染色顯示，與法舒地爾治療組相比，EAE對(duì)照組白質(zhì)出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中腰膨大部位明顯，炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞計(jì)數(shù)為368.00±57.07，而法舒地爾治療組為75.67±9.29，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。髓鞘染色顯示EAE對(duì)照組出現(xiàn)大量髓鞘脫失，而法舒地爾治療組髓鞘脫失被有效抑制。EAE對(duì)照組髓鞘脫失與白質(zhì)面積比值為(25.6±8.6)%，法舒地爾組為(4.1±1.3)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

3法舒地爾對(duì)脾巨噬細(xì)胞的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志CD16/32和M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志CD206和IL-10,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，法舒地爾治療并不能明顯影響M1型細(xì)胞CD16/32的表達(dá)，但可以明顯增加M2型細(xì)胞CD206和IL-10的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。計(jì)算M1型表面標(biāo)志CD16/32和CD206表達(dá)的比值，發(fā)現(xiàn)法舒地爾組表達(dá)比值明顯低于EAE對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。上述結(jié)果提示法舒地爾口服治療可以誘導(dǎo)炎癥M1型巨噬細(xì)胞向抗炎的M2型轉(zhuǎn)化。

Figure 2. The Luxol fast blue myelin staining and HE staining of mouse spinal cord in EAE group and fasudil intervention group.Mean±SD.n=7.*P<0.05vsEAE group.

圖2EAE組和法舒地爾組小鼠脊髓HE染色和髓鞘染色及統(tǒng)計(jì)

Figure 3. The effect of fasudil on the phenotype of splenic macrophages. Cells were stained with macrophage marker CD11b and M1/M2 markers, and the polarization of M1/M2 was analyzed using flow cytometry. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsEAE group.

圖3法舒地爾對(duì)脾巨噬細(xì)胞表型的影響

4法舒地爾對(duì)細(xì)胞因子的影響

采用ELISA法對(duì)培養(yǎng)48 h后脾細(xì)胞上清液IL-1β、IL-10和TNF-α進(jìn)行檢測(cè)。法舒地爾治療組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和TNF-α濃度明顯低于EAE對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而IL-10的濃度則增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。這一結(jié)果表明，法舒地爾治療可有效抑制EAE小鼠外周免疫性炎癥反應(yīng)。

Figure 4. Fasudil inhibited the production of inflammatory cytokines.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsEAE group.

圖4法舒地爾抑制炎癥因子的釋放

討 論

鑒于MS的病因及發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性[5]，目前針對(duì)MS尚缺乏有效的治療。MS的治療多采取靜脈滴注或皮下、肌內(nèi)注射類固醇藥物、免疫修飾藥物如醋酸格拉默和IFN-β，免疫調(diào)節(jié)藥物如免疫球蛋白等。這類藥物雖對(duì)MS的病程有所緩解，但其價(jià)格昂貴，遠(yuǎn)期使用副作用大，如醋酸格拉默易引起肝功能異常、流感樣病變，IFN-β易引起局部皮膚紅腫及全身反應(yīng)明顯[6]。而且靜脈、皮下注射給藥途徑長(zhǎng)期使用對(duì)患者造成不便和痛苦，并導(dǎo)致患者的依從性差。雖然目前已有MS的口服藥物，但價(jià)格非常昂貴，病人使用受到很大局限。因此，探討新的安全可靠、簡(jiǎn)捷有效的口服治療MS藥物具有重要的臨床實(shí)際意義。

法舒地爾作為一種選擇性Rho激酶抑制劑，臨床上主要治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后血管痙攣。由于其副作用小、作用靶點(diǎn)多，在神經(jīng)退行性疾病中可能表現(xiàn)良好的治療潛能。Sun等[7]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)腹腔注射法舒地爾可減少EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和外周特異性淋巴細(xì)胞的數(shù)目。Feske等[8]指出，法舒地爾可以促進(jìn)EAE小鼠神經(jīng)軸突再生，減低血管通透性，抑制炎癥細(xì)胞聚集和炎癥因子的釋放。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾腹腔注射可明顯改善EAE小鼠臨床癥狀，并可下調(diào)NF-κB[9]和抑制occludin的表達(dá)[10]，減少炎癥浸潤(rùn)和髓鞘脫失。但是，法舒地爾的靜脈劑型不適合MS病人的長(zhǎng)期使用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)法舒地爾的口服途徑，研究其對(duì)EAE的治療效果。結(jié)果顯示法舒地爾口服可延遲EAE的發(fā)病，緩解EAE的癥狀，降低脊髓的炎癥反應(yīng)和髓鞘脫失。目前關(guān)于探討法舒地爾給藥途徑的實(shí)驗(yàn)研究大多是腹腔注射，而法舒地爾口服給予治療EAE的研究尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道?？紤]到MS是一個(gè)需要長(zhǎng)期治療的疾病，因此口服治療尤其顯得重要和必要。口服途徑作為臨床上最常用的給藥方式，與臨床靜脈給藥相比，具有安全、簡(jiǎn)便、患者依從性好等優(yōu)點(diǎn)。盡管口服治療有效，但其效果似乎不如腹腔給予，我們?nèi)詫⑦M(jìn)一步研究試圖提高其治療的效果，為今后臨床法舒地爾口服治療MS提供了可行性。

已有研究表明，巨噬細(xì)胞在EAE的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用[11]?，F(xiàn)有研究證實(shí)巨噬細(xì)胞可分為M1和M2型，M1型由Th1細(xì)胞分泌的致炎癥因子如IFN-γ、IL-6、TNF-α誘導(dǎo)激活，高表達(dá)IL-1β、TNF-α等促炎因子，促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)。而M2型可由Th2細(xì)胞分泌抑炎因子如IL-10、TGF-β1等選擇性激活，可高表達(dá)IL-10和TGF-β1抑制炎癥。正常情況下，這兩類細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子相互制約以致動(dòng)態(tài)平衡，達(dá)到免疫穩(wěn)態(tài)的效果。目前的研究提示EAE的發(fā)病機(jī)制與M1和M2之間細(xì)胞因子分泌失衡有關(guān)[12]。細(xì)胞因子微環(huán)境決定巨噬細(xì)胞M1和M2的極化。已有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，法舒地爾可直接促進(jìn)炎癥MI巨噬細(xì)胞向M2轉(zhuǎn)化[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，法舒地爾口服治療雖不能影響M1型表面標(biāo)志CD16/32的表達(dá)，但可以明顯增加M2型表面標(biāo)志CD206和細(xì)胞因子IL-10表達(dá)，其平衡明顯偏向M2表型，即表現(xiàn)為M1與M2巨噬細(xì)胞比值降低。這些結(jié)果提示法舒地爾口服治療可誘導(dǎo)炎癥M1巨噬細(xì)胞向抗炎M2型細(xì)胞分化。這一結(jié)果很可能與我們觀察到的法舒地爾口服治療減低炎癥細(xì)胞因子分泌密切相關(guān)。

綜上所述，法舒地爾口服治療可以有效改善EAE的臨床癥狀，抑制炎癥病灶并改善髓鞘脫失，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極性，抑制系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。進(jìn)一步的深入研究仍然必要，以便為今后臨床使用法舒地爾口服治療提供新的思路和奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 李 勇,鄭榮遠(yuǎn),李劍敏,等. 實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎大鼠模型的復(fù)制[J]. 中國(guó)病理生理雜志,2005,21(2):414-416.

[2] Liu CY, Li YH, Yu JZ, et al. Targeting the shift from M1 to M2 macrophages in experimental autoimmune encephalomyelitis mice treated with fasudil[J]. PLoS One, 2013，8(2):e54841.

[3] Fagone P, Mangano K, Quattrocchi C, et al. Prevention of clinical and histological signs of proteolipid protein (PLP)-induced experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice by the water-soluble carbon monoxide-releasing molecule (CORM)-A1[J]. Clin Exp Immunol, 2011，163(3): 368-374.

[4] Kafami L, Raza M, Razavi A, et al. Intermittent feeding attenuates clinical course of experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice[J]. Avicenna J Med Biotechnol, 2010,2(1):47-52.

[5] 謝富華,熊旭明,梁 兵,等. 雷公藤多苷聯(lián)合地塞米松對(duì)EAE中TLRs/NF-κB信號(hào)通路的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志,2012,28(11):1961-1965.

[6] Goodin D. Comparative studies of glatiramer acetate and interferon beta[J]. Int MS J, 2008， 15(2): 39-41.

[7] Sun X, Minohara M, Kikuchi H, et al . The selective Rho-kinase inhibitor Fasudil is protective and therapeutic in experimental autoimmune cephalomyelitis[J]. J Neuroimmunol， 2006，180(1-2):126-134.

[8] Feske SK, Sorond FA, Henderson GV, et al . Increased leukocyte ROCK activity in patients after acute ischemic stroke[J]. Brain Res， 2009，1257:89-93.

[9] 侯紹蔚,劉岳婷,郭敏芳,等. 鹽酸法舒地爾治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的潛能與抗炎作用[J]. 中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué), 2012，20(2): 126-134.

[10] 劉岳婷, 侯紹蔚, 劉春云,等 法舒地爾通過(guò)誘導(dǎo)EAE小鼠Occludin表達(dá)抑制其炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[J]. 中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志, 2012，19(3): 206-210.

[11] Mensah-Brown EP, Shahin A, Al Shamisi M, et al. Early influx of macrophages determines susceptibility to experimental allergic encephalomyelitis in Dark Agouti (DA) rats[J]. J Neuroimmunol, 2011，232 (1-2): 68-74.

[12] Filion LG, Graziani-Bowering G, Matusevicius D, et al. Monocyte-derived cytokines in multiple sclerosis[J]. Clin Exp Immunol, 2003，131(2): 324-334.

[13] 張海飛, 郭敏芳, 孟 健,等. 法舒地爾對(duì)LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞表型演變的影響[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2012，28(8): 818-821.

Oraladministrationoffasudilhydrochloridesuppressesdevelopmentofexperimentalautoimmuneencephalomyelitisinmice

ZHANG Hui1,2, ZHANG Hai-fei2,3, LI Yan-hua2, LIU Chun-yun2, YU Jie-zhong2, DING Zhi-bin1,2, YANG Xing-wang2,5, YANG Wan-fang5, LI Jun-lian5, FENG Qian-jin5, FENG Ling2, XIAO Bao-guo2,4, MA Cun-gen1,2,5

(1DepartmentofNeurology,theFirstClinicalMedicalCollege,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2InstituteofBrainScience,ShanxiDatongUniversity,Datong037009,China;3DepartmentofNeurology,theFifthPeople’sHospitalofDatongCity,Datong037009,China;4InstituteofNeurology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200025,China;5DepartmentofEncephalopathy,NationalMajorClinicalDepartmentofMinistryofHealth,theThirdHospital,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Taiyuan030024,China.E-mail:macungen2001@163.com)

AIM: To explore the therapeutic effect of fasudil hydrochloride by the oral route on the development of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice and its possible mechanism.METHODSThe EAE model in female C57BL/6 mice was established by myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide(MOG35-55) immunization and the immunized mice were randomly divided into saline control group and fasudil intervention group, in which saline and fasudil were administered by the oral route once every day from post-immunization (PI) day 3 to day 27. Clinical score and body weight were recorded every other day. On PI day 28, the spinal cords were obtained for HE and myelin staining. The splenocytes were isolated and the expression of CD16/32, CD206 and interleukin (IL)-10 was analyzed by flow cytometry. The levels of IL-1β and tumor necrosis factor α (TNF-α) were detected by ELISA.RESULTSOral administration of fasudil delayed the onset of EAE, and attenuated the myelinoclasis of the model animals and the severity of EAE, accompanied by the phenotypic switch from M1 to M2 macrophages, the inhibition of the proinflammatory cytokine (IL-1β and TNF-α) production and the increase in IL-10 release.CONCLUSIONOral administration of fasudil exhibits therapeutic effect on the development of EAE possibly through switching M1 macrophages to M2 phenotype and inhibiting inflammatory responses in mice.

Fasudil; Oral administration; Experimental autoimmune encephalomyelitis; Macrophages; Cytokines

R320.54

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.026

1000- 4718(2013)11- 2060- 06

2013- 07- 22

2013- 09- 22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81070957; No.81272163);山西中醫(yī)學(xué)院“2011計(jì)劃”培育計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2011PY-1);2013年度國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(No.2013DFA30700);山西省青年自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2012021034-2);山西大同大學(xué)青年科學(xué)研究項(xiàng)目(No.2010Q6)

△通訊作者Tel: 0351-2272208; E-mail: macungen2001@163.com