鹽皮質(zhì)激素受體在博來霉素誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性肺纖維化中的作用*

胡道川， 姬文婕， 陳雪芬， 馬永強(qiáng)， 周 欣， 魏路清△

(武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 1呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科， 2心臟中心，武警部隊(duì)心血管病研究所， 天津 300162)

▲并列第1作者

鹽皮質(zhì)激素受體在博來霉素誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性肺纖維化中的作用*

胡道川1▲， 姬文婕1▲， 陳雪芬1， 馬永強(qiáng)1， 周 欣2， 魏路清1△

(武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院1呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，2心臟中心，武警部隊(duì)心血管病研究所， 天津 300162)

目的研究鹽皮質(zhì)激素受體(MR)在博來霉素誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性肺纖維化進(jìn)展過程中的作用及機(jī)制。方法將126只6～8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、博來霉素組和MR阻斷劑螺內(nèi)酯干預(yù)組，氣管內(nèi)一次性滴注博來霉素(2.5 mg/kg)溶液建立實(shí)驗(yàn)性小鼠肺纖維化模型，螺內(nèi)酯干預(yù)組每天按螺內(nèi)酯20 mg/kg經(jīng)灌胃給藥。于術(shù)后12 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d和28 d處死小鼠，采用HE染色和Masson染色觀察肺組織病理學(xué)變化及纖維化程度，采用real-time PCR檢測(cè)各組肺組織中膠原1(Col1)、Col3、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)及MR mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果(1)與對(duì)照組小鼠相比，博來霉素組及螺內(nèi)酯干預(yù)組小鼠在滴注博來霉素后經(jīng)歷了典型的急性炎癥期(12 h～3 d)、纖維化進(jìn)展期(14 d)和纖維化晚期(28 d)。阻斷MR下調(diào)早期炎癥反應(yīng)并減輕了纖維化程度。(2)螺內(nèi)酯干預(yù)可以有效降低MR mRNA表達(dá)水平；阻斷MR在急性炎癥期顯著下調(diào)MCP-1 mRNA的表達(dá)，在14 d顯著下調(diào)TGF-β、Col1和Col3 mRNA表達(dá)水平。結(jié)論(1)阻斷MR可以明顯減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化程度；(2)阻斷MR可能通過在急性炎癥期調(diào)節(jié)MCP-1和TGF-β的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，并在纖維化進(jìn)展期，下調(diào)TGF-β的表達(dá)，從而抑制肺纖維化的進(jìn)展。

肺纖維化； 受體，鹽皮質(zhì)激素； 博來霉素； 螺內(nèi)酯

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種原因不明的進(jìn)展性、致死性的纖維化性間質(zhì)性肺炎。目前，IPF的發(fā)病機(jī)制尚不明確，尚無有效治療手段。IPF患者診斷后的平均存活時(shí)間僅為2～5年[1]。鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor, MR)是一種典型的胞核甾體類激素受體，它的經(jīng)典配體為醛固酮。MR在機(jī)體內(nèi)表達(dá)廣泛。在腎臟、肺臟、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)組織以及心臟等部位均有表達(dá)[2]。MR活化除了調(diào)節(jié)水鹽平衡以外，還參與誘導(dǎo)炎性反應(yīng)、膠原形成、纖維化、細(xì)胞壞死、代謝綜合征等病理生理過程[3]。目前，鮮有關(guān)于MR與肺纖維化關(guān)系的研究。本研究使用博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，采用MR阻斷劑(螺內(nèi)酯)阻斷MR，檢測(cè)MR、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor β, TGF-β)mRNA在纖維化過程中的表達(dá)情況，探討MR在博來霉素誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性肺纖維化進(jìn)展過程中的作用及分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重16～20 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK-(軍)2007-004。

2主要試劑

注射用鹽酸平陽霉素(博來霉素A5，天津太河制藥有限公司)，螺內(nèi)酯(Sigma)，TRIzol Reagent(Invitrogen)，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs(Promega)，SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(Roche)，戊巴比妥鈉(Sigma)，其余國(guó)產(chǎn)試劑均為分析純。

3主要方法

3.1動(dòng)物模型的制備、標(biāo)本的采集與處理 隨機(jī)將126只C57BL/6小鼠分為對(duì)照組(control)、博來霉素組(bleomycin, Bleo)和螺內(nèi)酯(spironolactone, Spiro)干預(yù)組(Bleo+Spiro)，每組42只。腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉后，在無菌條件下，于頸部正中縱向剪開皮膚，逐層分離肌肉，暴露氣管。博來霉素組按劑量2.5 mg/kg體重，經(jīng)氣管內(nèi)一次性注入博來霉素生理鹽水溶液0.05 mL，按摩胸腔，使藥物分布均勻。最后縫合皮膚，常規(guī)喂養(yǎng)。對(duì)照組氣管內(nèi)注入等體積生理鹽水。螺內(nèi)酯干預(yù)組螺內(nèi)酯按20 mg/kg，每天1次，經(jīng)灌胃給藥。各組小鼠分別于模型制備完畢后第12 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d和28 d，麻醉后摘眼球放血致死，每組各取6只，開胸將肺臟連同氣管取出，分離左肺，4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)石蠟包埋切片，行HE染色和Masson染色；右肺凍存于液氮中，用于肺組織RNA的提取與分析。

3.2病理學(xué)分析 肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，切片(5 μm)，按常規(guī)方法進(jìn)行HE染色和Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的炎癥反應(yīng)和纖維化程度。

3.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肺組織中目的基因的表達(dá) 按照試劑說明書標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，采用TRIzol Reagent提取各組組織的總RNA，Nanodrop 2000c紫外/可見分光光度儀對(duì)其定量。RNA甲醛變性電泳法驗(yàn)證其完整性后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以SYBR Green法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中目的基因cDNA序列，使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1 目的基因引物序列

F: forward primer; R: reverse primer.

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1各組小鼠肺組織的病理學(xué)變化

光鏡下可見，對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)未見膠原沉積。博來霉素組小鼠在滴注博來霉素后第3天表現(xiàn)為明顯的急性炎癥反應(yīng)，肺泡壁水腫，肺間質(zhì)內(nèi)可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；第7天肺泡間隔增厚，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，Masson染色示肺間質(zhì)少量膠原沉積；第14天炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肺泡間隔明顯增厚，膠原沉積明顯增多，肺泡結(jié)構(gòu)破壞、塌陷；第28天肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡腔融合，肺間質(zhì)膠原沉積較第14天有所減少。與對(duì)照組小鼠相比，博來霉素組小鼠在滴注博來霉素后經(jīng)歷了典型的急性炎癥期(12 h～3 d)、纖維化進(jìn)展期(14 d)和纖維化晚期(28 d)，見圖1。

Figure 1. Histologic evaluation of control and bleomycin-treated (3, 7, 14 and 28 d) mouse lung tissues (×200).

圖1對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠在滴注博來霉素后第3天、7天、14天和28天肺組織HE染色和Masson染色

與博來霉素組相比，螺內(nèi)酯干預(yù)后的小鼠肺臟炎癥反應(yīng)明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，見圖2；在纖維化進(jìn)展期(14 d)，螺內(nèi)酯干預(yù)組纖維化程度顯著減輕，膠原沉積面積統(tǒng)計(jì)存在顯著差異，見圖3。

2肺組織中膠原1(collagen1，Col1)和Col3mRNA的表達(dá)

與博來霉素組相比，螺內(nèi)酯干預(yù)組在第14天Col1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖4A；Col3 mRNA表達(dá)量在第7天和第14天均顯著下降(P<0.05和P<0.01)，見圖4B。

3肺組織中MR、MCP-1和TGF-βmRNA的表達(dá)

在急性炎癥期和纖維化進(jìn)展期，螺內(nèi)酯干預(yù)組肺組織中MR mRNA表達(dá)水平較博來霉素組顯著降低，見圖5A。

博來霉素組小鼠肺組織中MCP-1 mRNA表達(dá)水平在急性炎癥期明顯高于對(duì)照組及螺內(nèi)酯干預(yù)組，此外還顯著高于其第7天和第14天的表達(dá)水平(P<0.05)；螺內(nèi)酯干預(yù)組MCP-1 mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)，見圖5B。

在第3天，與博來霉素組相比，螺內(nèi)酯干預(yù)組小鼠肺組織中TGF-β mRNA的表達(dá)顯著增高(P<0.05)，第14天，螺內(nèi)酯干預(yù)組TGF-β mRNA的表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，見圖5C。

討 論

博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型是目前應(yīng)用最廣泛的IPF模型[4]。給予博來霉素后首先引起小鼠肺上皮細(xì)胞損傷，繼而導(dǎo)致以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致肺纖維化。在炎癥反應(yīng)期，多種炎癥趨化因子、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)升高[5]。這些介質(zhì)通過募集、活化和促進(jìn)成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞增殖來發(fā)揮其促纖維化作用。炎癥反應(yīng)對(duì)于肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。

Figure 2. Histologic changes of lung tissues from each group 12 h, 24 h, 48 h, 3 d and 7 d after intratracheal instillation of bleomycin(HE staining,×200).

圖2各組小鼠在第12h、24h、48h、3d和7d肺組織HE染色

Figure 3. Masson trichrome staining (×200) revealed that pulmonary fibrosis was attenuated in Bleo+Spiro-treated mice on the 14th day after intratracheal instillation of Bleo.Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsBleo.

圖3各組小鼠在第14天肺組織Masson染色

Figure 4. Expression of collagen 1 (Col1) mRNA (A) and Col3 mRNA (B) in Bleo and Bleo+Spiro groups.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsBleo.

圖4螺內(nèi)酯干預(yù)后小鼠肺臟中Col1和Col3mRNA表達(dá)水平顯著下降

Figure 5. Expression of MR (A), MCP-1 (B) and TGF-β (C) mRNA in Bleo and Bleo+Spiro groups.*P<0.05,**P<0.01vsBleo+Spiro;#P<0.05vsBleo at 7 d.

圖5螺內(nèi)酯干預(yù)后小鼠肺臟中MR、MCP-1和TGF-βmRNA表達(dá)水平

MR是一種典型的胞核甾體類激素受體，它的經(jīng)典配體為醛固酮。MR在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，并發(fā)揮著多種生物學(xué)功能。MR參與調(diào)節(jié)水鹽平衡、誘導(dǎo)炎性反應(yīng)、纖維化、細(xì)胞凋亡、代謝綜合征等病理生理過程，MR的活化可以增強(qiáng)NAPDH氧化酶的活性，產(chǎn)生大量氧自由基[6]。Habibi等[7]闡明氧化應(yīng)激水平的上調(diào)是MR介導(dǎo)纖維化的關(guān)鍵機(jī)制之一。MR在免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞均有表達(dá)。MR的活化狀態(tài)與免疫狀態(tài)密切相關(guān)。MR活化可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞從血管滲出，增加促炎因子的產(chǎn)生與釋放，促進(jìn)炎癥狀態(tài)[2]。Bergmann等[8]發(fā)現(xiàn)激活的MR可以通過激活NF-κB，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞分泌MCP-1、IL-1、TNF-α等大量的促炎因子，從而誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)處于激發(fā)狀態(tài)。這些炎癥因子在纖維化的起始環(huán)節(jié)發(fā)揮了非常重要的作用[9]。MR的激活可以上調(diào)如TGF-β的合成與分泌[10]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子是肺纖維化發(fā)病過程中最重要的細(xì)胞活性物質(zhì)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)EMT，激活成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成肌成纖維細(xì)胞，并直接刺激成纖維細(xì)胞合成、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展[11]。Rickard等[12]研究發(fā)現(xiàn)通過基因敲除巨噬細(xì)胞的MR可以抑制去氧皮質(zhì)酮/鹽誘導(dǎo)的心肌纖維化，許明等[13]也發(fā)現(xiàn)使用安體舒通抑制MR可以改善自發(fā)性高血壓大鼠的心肌纖維化。

目前，鮮有關(guān)于MR與肺纖維化關(guān)系的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1 mRNA表達(dá)趨勢(shì)與MR相一致。在急性炎癥期博來霉素組小鼠MCP-1 mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。阻斷MR可能通過調(diào)控MCP-1的表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在給予博來霉素后第3天，阻斷MR還可能通過上調(diào)TGF-β的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用；而在第14天，博來霉素組小鼠肺臟中TGF-β的合成與分泌顯著升高，促進(jìn)肺纖維化。

綜上所述，MR參與了肺纖維化的發(fā)生與進(jìn)展過程，阻斷MR可能主要通過影響MCP-1和TGF-β的表達(dá)，減輕早期炎癥反應(yīng)，并在纖維化進(jìn)展期抑制TGF-β的合成，從而發(fā)揮抑制肺纖維化的作用。下一步研究擬通過阻斷或者激活MR的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討MR在肺纖維化中發(fā)揮促纖維化作用的具體分子機(jī)制及其作為肺纖維化預(yù)防和治療靶點(diǎn)的可能性。

[1] Raghu G, Collard HR, Egan JJ, et al. An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement: idiopathic pulmonary fibrosis: evidence-based guidelines for diagnosis and management [J]. Am J Respir Crit Care Med, 2011, 183(6):788-824.

[2] Herrada AA, Campino C, Amador CA, et al. Aldosterone as a modulator of immunity: implications in the organ damage [J]. J Hypertens, 2011, 29(9):1684-1692.

[3] Parthasarathy HK, MacDonald TM. Mineralocorticoid receptor antagonists [J]. Curr Hypertens Rep, 2007, 9(1):45-52.

[4] Moore BB,Hogaboam CM. Murine models of pulmonary fibrosis [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2008, 294(2):L152-L160.

[5] Wilson MS, Wynn TA. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation [J]. Mucosal Immunol, 2009, 2(2):103-121.

[6] Dharmashankar K, Widlansky ME. Vascular endothelial function and hypertension: insights and directions [J]. Curr Hypertens Rep, 2010, 12(6):448-455.

[7] Habibi J, DeMarco VG, Ma L, et al. Mineralocorticoid receptor blockade improves diastolic function independent of blood pressure reduction in a transgenic model of RAAS overexpression [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2011, 300(4):H1484-H1491.

[8] Bergmann A, Eulenberg C, Wellner M, et al. Aldosterone abrogates nuclear factor κB-mediated tumor necrosis factor alpha production in human neutrophils via the mineralocorticoid receptor [J]. Hypertension, 2010, 55(2):370-379.

[9] King TE Jr, Pardo A, Selman M. Idiopathic pulmonary fibrosis [J]. Lancet, 2011, 378(9807):1949-1961.

[10] Hisaki R, Fujita H, Saito F, et al. Tempol attenuates the development of hypertensive renal injury in Dahl salt-sensitive rats [J]. Am J Hypertens, 2005, 18(5 Pt 1):707-713.

[11] Strieter RM, Mehrad B. New mechanisms of pulmonary fibrosis [J]. Chest, 2009, 136(5):1364-1370.

[12] Rickard AJ, Morgan J, Tesch G, et al. Deletion of mineralocorticoid receptors from macrophages protects against deoxycorticosterone/salt-induced cardiac fibrosis and increased blood pressure [J]. Hypertension, 2009, 54(3):537-543.

[13] 許 明, 楊漢東, 閔新文, 等. 安體舒通改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2008, 24( 7): 1281-1285.

Roleofmineralocorticoidreceptorinbleomycin-inducedpulmonaryfibrosis

HU Dao-chuan1, JI Wen-jie1, CHEN Xue-fen1, MA Yong-qiang1, ZHOU Xin2, WEI Lu-qing1

(1DepartmentofRespiratoryMedicineandIntensiveCareUnit,2CardiacCenter,InstituteofCardiovascularDiseases,HospitalAlliliatedtoLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China.E-mail:luqing-wei@163.com)

AIM: To investigate the role of mineralocorticoid receptor (MR) in the lungs of experimental fibrotic mice.METHODSC57BL/6 male mice (6～8 weeks old) were randomly divided into control group, bleomycin treatment group (Bleo) and bleomycin+spironolactone treatment group (Bleo+Spiro). For induction of pulmonary fibrosis, the mice were administered bleomycin at dose of 2.5 mg/kg dissolved in 50 μL saline by the intratracheal route or given 50 μL sterile saline as control. The mice in Bleo+Spiro group were treated with spironolactone (20 mg/kg) daily by oral gavage throughout the experiment. The mice were sacrificed at 12 h, 1 d, 2 d, 3 d, 7 d, 14 d and 28 d after administration of bleomycin. HE staining and Masson’s trichrome staining were used to conduct histopathologic examination. The mRNA expression levels of collagen 1 (Col1), collagen 3 (Col3), transforming growth factor beta (TGF-β), monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), and MR were examined by real-time PCR.RESULTSThe results of histological analysis revealed the classical pathological stages of bleomycin-induced lung fibrosis, including acute inflammation phase (from 12 h to 3 d), progressive fibrosis phase (14 d) and late fibrosis phase (28 d). Compared with Bleo group, the inflammatory responses of the lungs in Bleo+Spiro group were attenuated in the acute inflammation phase and the degree of fibrosis was significantly reduced at 14 d after administration of bleomycin. Treatment with spironolactone effectively down-regulated the mRNA expression of MR. The levels of MCP-1 (in the acute inflammation phase), TGF-β (at 14 d), Col1 and Col3 (at 14 d) were also significantly reduced.CONCLUSIONBlockage of MR significantly attenuates the degree of bleomycin-induced pulmonary fibrosis by regulating the production and secretion of MCP-1 and TGF-β, thus reducing the degree of inflammation and inhibiting the expression of TGF-β in the progressive fibrotic phase.

Pulmonary fibrosis; Receptors, mineralocorticoid; Bleomycin; Spironolactone

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.022

1000- 4718(2013)11- 2039- 05

2013- 06- 19

2013- 09- 27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81102088)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目(No.11JCYBJC11800;No.12JCYBJC16600)；武警醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No.WYB201108)

△通訊作者 Tel: 022-60577559; E-mail: luqing-wei@163.com