PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡*

費(fèi)洪榮， 趙 瑩， 王桂玲， 曲曉蘭， 王鳳澤

(泰山醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院， 2生物科學(xué)學(xué)院， 3醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，山東 泰安 271016)

PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡*

費(fèi)洪榮1， 趙 瑩1， 王桂玲1， 曲曉蘭1， 王鳳澤2,3△

(泰山醫(yī)學(xué)院1藥學(xué)院，2生物科學(xué)學(xué)院，3醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，山東 泰安 271016)

目的檢測(cè)PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的分子機(jī)制。方法MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化；Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法測(cè)定細(xì)胞凋亡；免疫印跡分析細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果PF-04691502處理SGC-7901細(xì)胞后，降低細(xì)胞的活力并促進(jìn)細(xì)胞阻滯于G1期，同時(shí)抑制cyclin D1的表達(dá)并上調(diào)p21的蛋白水平。PF-04691502可明顯誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與其促進(jìn)caspase家族成員的活化并切割聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase, PARP] 底物密切相關(guān)。結(jié)論P(yáng)I3K/mTOR 雙重抑制劑PF-04691502能夠通過(guò)阻滯細(xì)胞周期來(lái)抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖，同時(shí)能夠激活細(xì)胞內(nèi)caspase，使PARP發(fā)生剪切而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

PF-04691502； PI3K/mTOR； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶類

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/Akt/mTOR)信號(hào)途徑作為真核細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。 PI3K是一個(gè)脂激酶家族，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等生命過(guò)程；mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其羧基末端與PI3K催化區(qū)高度同源，是PI3K信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點(diǎn)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，多種實(shí)體瘤的發(fā)生與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的突變或過(guò)度活化密切相關(guān)，因此抑制該信號(hào)途徑已成為臨床上腫瘤治療的有效手段，篩選PI3K/Akt/mTOR抑制劑并研究其抑癌活性則具有重要的理論意義與治療價(jià)值[4-5]。本研究以人胃癌SGC-7901細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，檢測(cè)PI3K和mTOR的雙重靶向抑制劑PF-04691502對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響，從而為胃癌臨床用藥提供理論指導(dǎo)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)自南京凱基生物有限公司，于37 ℃和5% CO2條件下用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2試劑

PF-04691502 購(gòu)自 Selleck Chemicals；RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自 Gibco；MTT購(gòu)自Genview；propidium iodide (PI)購(gòu)自Sigma-Aldrich；Annexin V-FITC 購(gòu)自南京凱基生物有限公司；caspase-3抗體、caspase-8抗體、caspase-9抗體和多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；β-actin抗體購(gòu)自Sigma；cyclin D1抗體和p21抗體購(gòu)自Santa Cruz；Ⅱ抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。

3MTT檢測(cè)細(xì)胞活力

SGC-7901細(xì)胞接種于96孔板中，用不同劑量的PF-04691502 處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對(duì)照組加入DMSO；終止培養(yǎng)前4 h加20 μL(5 g/L)的MTT。吸去培養(yǎng)基后加入150 μL DMSO，室溫振蕩5～10 min；490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度，以同樣的方法測(cè)6個(gè)平行孔的吸光度讀數(shù)并計(jì)算平均值。

4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡

PF-04691502處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，胰酶消化并制備單細(xì)胞懸液；用75%冷無(wú)水乙醇4 ℃固定過(guò)夜后加入50 mg/L RNase A，37 ℃ 孵育30 min，加50 mg/L PI閉光染色 15 min，接著上機(jī)檢測(cè)并分析細(xì)胞的周期分布。細(xì)胞凋亡檢測(cè)操作參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，根據(jù)Annexin V和PI的熒光強(qiáng)度計(jì)算凋亡百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5免疫印跡實(shí)驗(yàn)

RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞20 min，4 ℃ 13 000×g離心20 min后收集上清并定量分析。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后加入Ⅰ抗；室溫孵育3 h后加入Ⅱ抗孵育1 h后暗室曝光顯影。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1PF-04691502抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖

SGC-7901細(xì)胞經(jīng)不同劑量的PF-04691502處理24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果見圖1，PF-04691502抑制了SGC-7901細(xì)胞的活力。

Figure 1. PF-04691502 reduced the viability of SGC-7901 cells. Cells were incubated with PF-04691502 at the indicated concentrations for 24 h and then processed for MTT assay. Mean±SD.n=6.

圖1MTT法檢測(cè)PF-04691502對(duì)SCC-7901細(xì)胞活力的抑制作用

2PF-04691502阻滯SGC-7901細(xì)胞于G1期

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了PF-04691502對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)PF-04691502作用于SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞明顯阻滯于G1期，而處于S期的細(xì)胞數(shù)目則明顯減少，見圖2。

Figure 2. PF-04691502 treatment resulted in cell cycle arrest at G1stage. SGC-7901 cells were exposed to different concentrations of PF-04691502 for 24 h. The cell cycle analysis was determined by PI staining and flow cytometry. Mean±SD.n=3.

圖2PF-04691502作用SGC-7901細(xì)胞24h后，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的變化

免疫印跡結(jié)果表明，PF-04691502誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯與其抑制cyclin D1的蛋白水平，并上調(diào)p21的表達(dá)密切相關(guān)，見圖3。

Figure 3. PF-04691502 down-regulated cyclin D1 expression and up-regulated p21 expression in SGC-7901 cells. Cells were cultured for 24 h in the presence of increasing doses of PF-04691502. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μ mol/L.

圖3PF-04691502對(duì)SGC-7901細(xì)胞中cyclinD1及p21表達(dá)的影響

3PF-04691502對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

SGC-7901細(xì)胞經(jīng)PF-04691502處理后，細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡，見圖4。

免疫印跡結(jié)果顯示，SGC-7901細(xì)胞經(jīng)PF-04691502作用24 h后，caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP出現(xiàn)明顯的活性切割，見圖5。

討 論

近年的研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)途徑參與腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、分化及血管生成等生命過(guò)程，設(shè)計(jì)篩選該信號(hào)通路的特異性抑制劑對(duì)癌癥的臨床治療具有非常重要的實(shí)際意義[6-7]。本研究檢測(cè)PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖及凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)PF-04691502抑制了胃癌細(xì)胞的生存力，且抑制作用呈劑量依賴性(圖1)。流式結(jié)果表明PF-04691502誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞阻滯于G1期，其機(jī)制與PF-04691502抑制SGC-7901細(xì)胞中cyclin D1的蛋白水平，增加了p21的表達(dá)相關(guān)。

化合物的抗癌活性與腫瘤細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切[8]。本研究檢測(cè)了PF-04691502對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)PF-04691502可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡的執(zhí)行可以通過(guò)內(nèi)源性和外源性2條途徑執(zhí)行。在內(nèi)源性的凋亡途徑中，細(xì)胞色素C 與凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)促使pro-caspase-9 與兩者結(jié)合形成凋亡小體同時(shí)活化caspase-9；激活的caspase-9 又活化caspase-3，將PARP切割成小片段，使PARP的活性喪失[9-10]。在本研究中，胃癌細(xì)胞SGC-7901 經(jīng)PF-04691502作用24 h后，促進(jìn)procaspase-9 和procaspase-3剪接成有活性的caspase-9 和caspase-3。在外源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中，細(xì)胞通過(guò)激活的死亡受體招募接頭蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)，F(xiàn)ADD進(jìn)而募集并激活caspase-8從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，caspase-8的切割產(chǎn)物隨著PF-04691502濃度的增加而增多(圖5) 。

Figure 4. PF-04691502 induced apoptosis of SGC-7901 cells. Cells were incubated with the indicated concentrations of PF-04691502 for 24 h, and the apoptosis was determined by Annexin V/PI staining analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖4AnnexinV/PI檢測(cè)PF-04691502對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5. PF-04691502 treatment activated the cleavage of caspase-3, caspase-8, caspase-9 and PARP in SGC-7901 cells．CF:cleaved fragment.

圖5PF-04691502對(duì)caspases家族主要蛋白因子和PARP活性切割的影響

總之，PF-04691502能夠抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞于G1期；PF-04691502可通過(guò)激活caspases的活性切割而誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象。本研究為PF-04691502用于胃癌的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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PI3K/mTORdualinhibitorPF-04691502inducesapoptosisofhumangastriccancerSGC-7901cells

FEI Hong-rong1, ZHAO Ying1, WANG Gui-ling1, QU Xiao-lan1, WANG Feng-ze2,3

(1SchoolofPharmacy,2SchoolofBiologicalSciences,3InstituteofMedicinalBiotechnology,TaishanMedicalUniversity,Taian271016,China.E-mail:wfz221@sina.com.cn)

AIM: To determine the antitumor effect of PF-04691502, a dual inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and mammalian target of rapamycin (mTOR), on the viability and apoptosis of human gastric cancer cell line SGC-7901.METHODSCell viability was analyzed by MTT assay. Cell cycle was detected by flow cytometry, and Annexin V-FITC/PI dual staining was used to detect cell apoptosis. Protein expression of p21, cyclin D1, caspase-3, caspase-8, caspase-9 and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) was determined by Western blotting.RESULTSMTT assay and cell cycle analysis results indicated that PF-04691502 inhibited the viability of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner, and arrested the cells in G1phase. PF-04691502 down-regulated the expression of cyclin D1 and up-regulated the expression of p21. In addition, SGC-7901 cells treated with PF-04691502 showed typical characteristics of apoptosis, accompanied by activation of caspases and cleavage of PARP.CONCLUSIONThe PI3K/mTOR dual inhibitor PF-04691502 induces the apoptosis and inhibited the growth of SGC-7901 cells, implicating its potential therapeutic value for the treatment of cancer.

PF-04691502; PI3K/mTOR; Cell proliferation; Apoptosis; Caspases

R966

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.008

1000- 4718(2013)11- 1962- 04

2013- 06- 04

2013- 07- 15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81272683)； 山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. ZR2011HQ034)

△通訊作者 Tel: 0538-6236075； E-mail:wfz221@sina.com.cn