擬南芥HSP70基因啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建及在煙草BY2細(xì)胞中的應(yīng)用

鄭 幫，陳 燕，褚艷霞，孫虎林，鄭亞潔，孫恒吉，司英語，周樹敏，張 衛(wèi)

(上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海200444)

0 引言

熱激蛋白HSP70是擬南芥HSP70基因家族中的一種，其表達(dá)會(huì)隨著溫度的升高而增強(qiáng)，即熱激特性［1］．這種熱激特性是由熱激蛋白HSP70的啟動(dòng)子決定的，因此擬南芥的HSP70基因啟動(dòng)子也成為研究的熱點(diǎn)之一．在以擬南芥植株為實(shí)驗(yàn)材料，將含有擬南芥的HSP70基因啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入其中進(jìn)行表達(dá)．受到植株生長周期長的影響，會(huì)造成實(shí)驗(yàn)周期長，對實(shí)驗(yàn)進(jìn)展造成一定的影響．煙草BY2細(xì)胞(Nicotiana tabacum L．cv Bright Yellow2，BY2)是非常重要而且用途廣泛的細(xì)胞系［2－3］，由 Kato 等于1972年分離得到［4］．BY2細(xì)胞可以比較容易地轉(zhuǎn)化外源基因，此外，BY2細(xì)胞系擁有高度的同一性，且生長迅速，可獲得具高度同周期性的BY2細(xì)胞，1周內(nèi)便可增加80～100倍．因此，BY2細(xì)胞已成為研究生物研究的模式系統(tǒng)［5］，而且轉(zhuǎn)基因BY2細(xì)胞團(tuán)和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞都較容易獲得．因此若能將含有擬南芥的HSP70基因啟動(dòng)子且以GFP為報(bào)告基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入其中，且可正常表達(dá)報(bào)告基因，則可明顯縮短實(shí)驗(yàn)周期，對熱激蛋白HSP70啟動(dòng)子的后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供大量豐富的實(shí)驗(yàn)材料．

1 材料

1．1 植物材料

本實(shí)驗(yàn)室自有擬南芥Columbia生態(tài)型(Arabidopsis thaliana)，置于溫度為22℃，光照為16 h光照，8 h黑暗的人工光照溫室培養(yǎng)［6］．實(shí)驗(yàn)室自有液體懸浮煙草 BY2細(xì)胞，27℃，130 r/min，暗培養(yǎng)［7］．培養(yǎng)基配方見參考文獻(xiàn)

1．2 引物和試劑

在www．a(chǎn)rabidopsis．org網(wǎng)站下載HSP70啟動(dòng)子的序列并依據(jù)啟動(dòng)子的序列設(shè)計(jì)引物，在上下游引物兩端分別加入HindⅢ和Sac1酶切位點(diǎn)．長度選取轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)至上游1．5 kbp．實(shí)驗(yàn)所用引物如表1所示．

實(shí)驗(yàn)室自有GFP－T質(zhì)粒．GFP基因序列已經(jīng)測序驗(yàn)證且正確．

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

引物合成由上海生工生物工程公司進(jìn)行合成．

PCR擴(kuò)增采用takara公司生產(chǎn)的KOD PCR擴(kuò)增試劑盒．PCR擴(kuò)增參數(shù)為:

膠回收試劑盒由takara公司生產(chǎn)的膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收．

pMD18－T載體和連接酶Solution I由TAKARA公司生產(chǎn)．連接體系(10μL)如下所示:

2 方法

2．1 基因組抽提

采用試劑盒抽提基因組的方法．試劑盒購自康為世紀(jì)生物技術(shù)公司．

2．2 表達(dá)載體的構(gòu)建流程

2．3 轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌

將構(gòu)建好的表達(dá)載體采用熱激轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，并對農(nóng)桿菌菌落進(jìn)行陽性克隆的篩選和鑒定．轉(zhuǎn)化方法詳見參考文獻(xiàn)［8－9］．

2．4 轉(zhuǎn)基因

(1)將鑒定已經(jīng)轉(zhuǎn)入表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101陽性克隆劃板，且挑取單克隆進(jìn)行小型搖培(5 mL)，繼而進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作．具體轉(zhuǎn)化步驟:

(2)從農(nóng)桿菌平板上挑取單菌落于2 mL LB培養(yǎng)基，250 r/min，28℃過夜，OD600至0．6．

(3)洗農(nóng)桿菌:1 mL菌液:2500 g離心10 min，室溫，去上清，加入1 mL 10 mmol/L MgSO4，混勻，2500 g離心10 min，去上清，加入1 mL 10 mmol/L MgSO4，混勻，加入2μL 200 mmol/L As(有利于轉(zhuǎn)化，也可不加)，室溫靜置2 h．

(4)分裝懸浮培養(yǎng)的煙草BY2細(xì)胞5 mL于小培養(yǎng)皿中(一般1個(gè)基因做2個(gè)，1個(gè)空白對照)，用移液器吹打20次，誘導(dǎo)缺口，有利于轉(zhuǎn)化．

(5)加入100μL處理好的農(nóng)桿菌，輕輕搖勻，對照加入100 lL ddH2O．

(6)28℃靜置暗培養(yǎng)48 h．

(7)每個(gè)培養(yǎng)皿中加入5 mL BY2液體培養(yǎng)基輕輕搖勻．

(8)轉(zhuǎn)入50 mL EP管，用BY2液體培養(yǎng)基補(bǔ)到總體積25 mL．

(9)1000 g離心5 min，室溫．

(10)小心倒去上清，均勻倒在含有潮霉素的BY2固體培養(yǎng)基平板．

(11)28℃靜置培養(yǎng)3周．

2．5 陽性克隆細(xì)胞團(tuán)的篩選

轉(zhuǎn)基因BY2細(xì)胞轉(zhuǎn)化后約3周可在50μg/mL的潮霉素和萬古霉素抗性平板上長出陽性單克隆的細(xì)胞團(tuán)，潮霉素起到篩選陽性克隆的作用，萬古霉素起抑制農(nóng)桿菌的生長，并將所篩選到的陽性單克隆細(xì)胞團(tuán)移出至新的50μg/mL的潮霉素抗性平板傳接一代，再接至液體培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，如圖1所示:

圖1 轉(zhuǎn)化后的BY2細(xì)胞傳代

3 結(jié)果

3．1 HSP70啟動(dòng)子克隆

從擬南芥基因組中PCR擴(kuò)增HSP70啟動(dòng)子(圖2)和HSP70啟動(dòng)子與T－載體連接后的酶切(圖3)鑒定電泳圖．

圖2 PCR擴(kuò)增HSP70啟動(dòng)子

圖3 HSP70啟動(dòng)子與T－載體連接后酶切鑒定

將HSP70啟動(dòng)子測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站的原始序列進(jìn)行比對，測序結(jié)果和原始序列完全匹配，無缺失、錯(cuò)配等．

HSP70啟動(dòng)子序列如圖4所示．

圖4 HSP70啟動(dòng)子序列

3．2 表達(dá)載體的鑒定

將構(gòu)建好的表達(dá)載體陽性克隆抽提質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定．對HSP70啟動(dòng)子采用HindⅢ和Sac I進(jìn)行雙酶切鑒定(圖5)，對GFP采用BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶切鑒定(圖6)，并用HindⅢ和Sal I進(jìn)行雙酶切切出HSP70啟動(dòng)子加GFP片段(圖7)，分別切出1．5 kb條帶，750 bp條帶，2．25 kb條帶以及剩余的載體條帶．酶切鑒定結(jié)果如圖7．

3．3 轉(zhuǎn)基因BY2細(xì)胞鑒定

對篩選到的陽性細(xì)胞團(tuán)基因組進(jìn)行PCR鑒定，PCR擴(kuò)增條帶包括GFP及HSP70啟動(dòng)子部分片段，長度約為550bp，抗性平板共篩選到11個(gè)陽性細(xì)胞團(tuán)，PCR鑒定結(jié)果如圖8．

圖5 HSP70啟動(dòng)子酶切鑒定

圖6 GFP酶切鑒定

圖7 HSP70啟動(dòng)子和GFP酶切鑒定

圖8 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞PCR鑒定

3．4 熒光觀察

通過采用激光共聚焦熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因即野生型(WT)BY2細(xì)胞的熒光觀察發(fā)現(xiàn)，野生型即非轉(zhuǎn)基因BY2細(xì)胞有極其微弱的自發(fā)熒光，幾乎看不到，但轉(zhuǎn)基因BY2細(xì)胞的熒光要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于野生型BY2細(xì)胞(圖9)．同時(shí)對野生型和熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量(圖10)．RT－PCR結(jié)果證明野生型BY2細(xì)胞中并無GFP的表達(dá)，而轉(zhuǎn)基因BY2細(xì)胞中表達(dá)很強(qiáng)(圖11)．

圖9 BY2細(xì)胞熒光觀察

圖10 熒光定量結(jié)果

圖11 RT－PCR結(jié)果

4 討論

擬南芥的HSP70基因啟動(dòng)子是一種熱激起動(dòng)子，對其的研究一直是現(xiàn)代生物學(xué)的熱點(diǎn)，其表達(dá)的強(qiáng)弱受到受到多方面因素的影響，如外界溫度，自身啟動(dòng)子的順式元件以及反式元件的協(xié)同作用［1］．隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)操作的很多環(huán)節(jié)均可采用試劑盒來快速完成實(shí)驗(yàn)的操作，大大節(jié)省了時(shí)間，但是植物種植的時(shí)間很難縮短，因此在實(shí)驗(yàn)材料的獲得上往往會(huì)限制實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展速度，具體以擬南芥為例，其生育周期常為42～56 d，在生長到20 d左右時(shí)可以轉(zhuǎn)化，收到種子干燥10 d后才可篩選陽性苗，在篩選陽性苗的過程中還要經(jīng)過春化，發(fā)苗等過程，在陽性苗生長到可以取材進(jìn)行時(shí)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)還要生長一段時(shí)間［10］，且植株生長周期有限，有幼苗期和衰老時(shí)期不可能隨時(shí)進(jìn)行取材，但是液體懸浮培養(yǎng)的BY2細(xì)胞生命周期短，轉(zhuǎn)接傳代操作簡單，可隨時(shí)取材進(jìn)行觀察，省去植物種植的時(shí)間，因此將擬南芥的HSP70基因啟動(dòng)子表達(dá)GFP的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入液體懸浮培養(yǎng)的BY2細(xì)胞，可在一次轉(zhuǎn)化后大量傳接培養(yǎng)，4～7 d便可傳代培養(yǎng)一次，相比于種植一代植物可節(jié)省大量時(shí)間，可明顯縮短后續(xù)實(shí)驗(yàn)的周期，且由于液體懸浮培養(yǎng)的BY2細(xì)胞繁殖快，可大量傳接，因此可以獲得大量的實(shí)驗(yàn)材料，從而利于對擬南芥的HSP70基因啟動(dòng)子的研究，并對其他基因的研究提供可借鑒的思路．

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