超聲提取茯苓中三萜類成分的工藝研究

張 方，陳 平

(武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023)

茯苓是多孔菌科真菌茯苓Poria Cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核［1］。茯苓在我國(guó)中藥史上，具有十分悠久的歷史。茯苓的適用范圍非常廣泛，可單用亦可配伍使用，是多種復(fù)方藥及中成藥的原料，自古就有“十藥九茯苓”的美談。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，茯苓亦被視為“上藥”，具有滲濕利水，健脾和胃，安魂養(yǎng)神延年之效。常用于治療小便不利，水腫脹滿，痰飲咳逆，心下結(jié)痛，脾虛少食，小兒驚厥，老人健忘等癥［2］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究，茯苓主要成分有多糖、三萜類化合物及少量脂肪酸和無(wú)機(jī)物。其中，多糖類如茯苓聚糖等具有明顯的抗癌抗腫瘤，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的作用，三萜類化合物及其衍生物有調(diào)節(jié)免疫的功能，具有良好地抗炎抗衰老的功效。

茯苓中的三萜成分主要為中等極性的同系物，性質(zhì)相近，提取時(shí)多用極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑甲醇、乙醇長(zhǎng)時(shí)間冷浸或回流提?。?-8］，亦有用弱極性的乙醚［10］和正己烷［11］回流提取的報(bào)道，提取液減壓濃縮至干，即得棕黃色含多種三萜成分的混合物。由于其中含有大量的β—茯苓聚糖，因此Tai等［8］通過(guò)將其懸于水中，然后用乙酸乙酯再次提取的方法進(jìn)行純化。

茯苓三萜成分彼此間的差異小，故其分離多采用層析法，首先將茯苓三萜成分的混合物加到硅膠柱上，用不同比例的甲醇—氯仿(0%—25%)溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液濃縮至干，再利用該柱或制備TLC、反相HPLC制備柱進(jìn)行分離，得到的單一成分在甲醇中結(jié)晶純化。如王利亞等應(yīng)用薄層層析從茯苓的乙醚、乙醇提取物中分離鑒別了8個(gè)三萜類化合物Ⅰ—Ⅷ［10］。許先棟等人研究證實(shí)其中羊毛甾烷三萜烯型中的茯苓環(huán)酮雙烯三萜酸是一類新的天然化合物［6］。但有些茯苓三萜成分由于彼此間只差一個(gè)雙鍵或?yàn)椴钕虍悩?gòu)體，極難分離，為了提高分離效率，可采用制備衍生物的方法，擴(kuò)大彼此間理化性質(zhì)的差異達(dá)到分離目的。近幾年Takaaki Tai等就采用N－氯甲基苯鄰二甲酰亞胺處理茯苓三萜成分的混合物得到相應(yīng)的N－甲基苯鄰二甲酰亞胺基酯，然后用TLC法分離確定了3β羥基羊毛甾烷8，24－二烯酸等茯苓三萜成分的結(jié)構(gòu)，并從茯苓皮中分離出3，4位開(kāi)環(huán)的三萜 porieoic acid A和 B;之后從茯苓中分離出三萜 dlhydropachymic acid和茯苓酸:此外還從茯苓皮中分得poricoic acid A，D，DM，AM 和三萜 trametenolicacid，eburicoic acid及其去氫化合物［9］。在茯苓三萜含量測(cè)定方面，王少軍等人利用改進(jìn)后簡(jiǎn)便、快速的茯苓中總?cè)祁惡康谋壬?，建立了茯苓三萜類的分析測(cè)定體系，以增強(qiáng)對(duì)茯苓藥材內(nèi)在質(zhì)量的控制［12］。本實(shí)驗(yàn)采用超聲法提取茯苓中三萜類化合物。

1 儀器與材料

1.1 試劑及試藥

茯苓(采自湖北省羅田九資河，經(jīng)專家鑒定為多孔菌科茯苓干燥菌核)，齊墩果酸(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)110709)，甲醇、三氯甲烷、甲酸、乙酸乙酯(分析純，上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司)，石油醚、異丙醇、丙酮(分析純，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)，水為超純水(自制)，95%乙醇(實(shí)驗(yàn)室自制)，香草醛，濃硫酸，冰醋酸。

1.2 儀器

雙頻超聲波清洗機(jī)SB-5200DTS(寧波心芝生物科技股份有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9140(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，電子天平AL204(Mettler-Toledo Group)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52-99(上海亞榮生化儀器廠)，循環(huán)水式真空泵SHE-D(Ⅲ)(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，薄層硅膠板(青島海浪硅膠干燥劑廠制造)，UA-5800PC紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材茯苓粉末的制備

先將茯苓藥材篩選、洗凈，以清除雜質(zhì)，再置于50℃烘箱中烘干，以降低藥材中的水分，干燥后的藥材先以小塊放入小型粉碎機(jī)中，旋緊蓋子后，再連上電源，啟動(dòng)定時(shí)開(kāi)關(guān)，粉碎藥品。然后倒入4號(hào)篩子中過(guò)篩，將過(guò)篩后的茯苓粉末裝入儲(chǔ)存袋中，放置于陰涼干燥處待用，將未過(guò)篩的藥材回收。

2.2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配置

齊墩果酸標(biāo)樣:精密稱取0.002 0 g齊墩果酸至25 mL的容量瓶中，用95%的乙醇定容至刻度，封蓋搖勻(濃度為0.08 mg/mL);新制香草醛溶液:準(zhǔn)確稱取香草醛2.500 g，置于50 mL錐形瓶中，加入25 mL冰醋酸，使之充分溶解。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取不同濃度的齊墩果酸標(biāo)樣溶液，在紫外—可見(jiàn)光區(qū)掃描，結(jié)果表明:標(biāo)樣溶液均在552 nm處有最大吸收，結(jié)果見(jiàn)圖1。因此，552 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，以后的測(cè)定均在此最佳波長(zhǎng)處測(cè)定。

圖1 齊墩果酸紫外吸收光譜圖

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6支試管，移取標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為0.02 mL，0.05 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.5 mL 于試管中，用吹風(fēng)機(jī)吹干溶劑。各加入香草醛—冰醋酸0.2 mL，濃硫酸0.8 mL，顯色。然后迅速置60℃水浴中15 min，取出后冰浴10 min，再加入5 mL冰醋酸震蕩均勻。在552 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，以齊墩果酸質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

圖2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量在0—0.04 mg范圍內(nèi)時(shí)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=17.32X+0.1168，相關(guān)系數(shù) R=0.999 8。

2.2.4 顯色反應(yīng)體系的穩(wěn)定性

按照實(shí)驗(yàn)方法，顯色后每隔10 min在552 nm處測(cè)定體系的吸光度，結(jié)果表明:反應(yīng)體系在100 min內(nèi)吸光度變化不大。

2.3 茯苓三萜類成分提取的正交試驗(yàn)

用電子天平精密稱取9份經(jīng)過(guò)前處理的茯苓粉末1.00 g，放入250 mL的錐形瓶?jī)?nèi)，按照正交表加入規(guī)定量的溶劑，搖勻，浸泡一晚上。然后放入超聲儀中提取(超聲儀設(shè)定溫度為25℃，頻率為25 kHz)，溶劑種類、溶劑用量、提取時(shí)間、次數(shù)，按表1的因素水平表進(jìn)行選取，以齊墩果酸為對(duì)照品測(cè)得的總?cè)频寐蕿榭疾熘笜?biāo)，選用表2所示的L9(34)正交表安排試驗(yàn)，提取液用甲醇補(bǔ)足減失的重量，并用微孔濾膜過(guò)濾，收取濾液，編號(hào)密封備用。

表1 因素水平表

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表

2.3.1 提取液中三萜類化合物的含量測(cè)定

樣品的制備:為了將試樣的濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，將試樣移取部分(體積V1見(jiàn)表3)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干，固體物質(zhì)用0.5 mL的甲醇溶解，取出，密封于EP管中。

實(shí)驗(yàn)方法:取10支試管，分別標(biāo)號(hào)0—9，其中0號(hào)試管為空白對(duì)照品。除0號(hào)試管以外，其他9號(hào)試管分別加入規(guī)定體積的濃縮液(體積V2見(jiàn)表3)，用吹風(fēng)機(jī)吹干溶劑。10支試管各加入香草醛—冰醋酸0.2 mL，濃硫酸0.8 mL顯色，然后迅速在60℃下水浴15 min，取出后冰浴10 min，再加入5 mL冰醋酸震蕩均勻。在552 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度A。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所測(cè)的含量m，通過(guò)濃縮體積計(jì)算總提取含量M。提取總含量計(jì)算公式:M=0.5m ×V0/(V2×V1)。

表3 三萜類化合物的含量測(cè)定結(jié)果

2.3.2 正交數(shù)據(jù)分析及結(jié)論

將實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果如表4和表5所示。

表4 直觀分析表

表5 方差分析表

研究表明:確定茯苓酸較優(yōu)的提取方式，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及查閱相關(guān)資料，篩選出對(duì)茯苓酸提取影響較大的幾個(gè)因素，即溶劑種類A、溶劑用量B、提取次數(shù)C、提取時(shí)間D。每個(gè)因素取三個(gè)水平，見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表5。直觀分析表明A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，D3＞D2＞D1，即 A3B2C3D3的提取率最高的組合。在方差分析表中，因素A和C對(duì)茯苓三萜類化合物的提取有顯著影響，而因素B和D沒(méi)有顯著影響。其影響大小為A＞C＞D＞B。因提取時(shí)間D、溶劑用量B對(duì)提取并沒(méi)有顯著影響，所以在考慮成品的情況下，優(yōu)先選出30 min，20倍溶劑用量作為提取時(shí)間和溶劑用量。最優(yōu)提取方案為A3B1C3D1。

2.4 三萜類化合物的薄層色譜鑒定

2.4.1 薄層色譜展開(kāi)劑的選擇

在參照各類文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，以及對(duì)天然產(chǎn)物中三萜類化合物的薄層色譜分離研究，選擇以下幾種展開(kāi)劑系統(tǒng)。

①三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲酸(10∶1∶0.2)。②石油醚∶乙酸乙酯(2∶1)。③異丙醇∶丙酮(3∶1)。④ 三氯甲烷∶甲醇(5∶1)。

2.4.2 薄層樣品的制備

鑒于各提取液中含量不一，為防止因含量太低而顯色不清晰，將提取液濃縮至一定體積，再進(jìn)行點(diǎn)樣處理。取一定的體積V0，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干溶液，再用0.5 mL甲醇溶解固體物質(zhì)，即得。薄層樣品的制備如表6所示。

表6 薄層樣品的制備

2.4.3 濃縮液的薄層展開(kāi)實(shí)驗(yàn)

點(diǎn)樣:首先觀察硅膠板是否有花斑、水印或是破損處。點(diǎn)樣時(shí)，先用鉛筆在硅膠板上距末端1 cm處輕輕畫(huà)一條橫線，然后用毛細(xì)管點(diǎn)樣針蘸取適量齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品液在橫線上輕輕點(diǎn)樣。采用分量多次點(diǎn)樣，每次點(diǎn)樣需用吹風(fēng)機(jī)吹干后再二次點(diǎn)樣，以免斑點(diǎn)擴(kuò)散。如果要重新點(diǎn)樣，一定要等前一次點(diǎn)樣殘余的溶劑揮發(fā)后再點(diǎn)樣，以免點(diǎn)樣斑點(diǎn)過(guò)大。一般斑點(diǎn)直徑大于2 mm，不宜超過(guò)5 mm。底線距基線1—2.5 cm，點(diǎn)間距離為1 cm左右，樣點(diǎn)與玻璃邊緣距離至少1 cm，為防止邊緣效應(yīng)，可將薄層板兩邊刮去1—2 cm，再進(jìn)行點(diǎn)樣。

展開(kāi):展開(kāi)劑在臨用時(shí)新配為宜。為達(dá)到飽和效果，可在展缸中加入足夠量的展開(kāi)劑，加蓋靜置0.5 h以上。用鑷子將點(diǎn)好樣的硅膠板放入展缸中，注意原點(diǎn)不能浸入展開(kāi)劑中，待展開(kāi)劑達(dá)到前沿(1—2 cm)時(shí)，取出硅膠板，晾干。

顯色:本法采用化學(xué)試劑顯色，配置10%濃硫酸乙醇溶液于浸漬槽中，將硅膠板插入浸漬槽中，充分浸漬，取出，在120℃下顯色。

2.4.4 顯色分析

硅膠板顯色后，觀察分離效果和顯色效果，并及時(shí)用相機(jī)拍照。結(jié)果如圖3所示。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在4種展開(kāi)劑下的薄層色譜圖

如圖3所示，0號(hào)為齊墩果酸對(duì)照品，1—9號(hào)分別為樣1到樣9。觀察薄層板上的分離狀況和是否有拖尾現(xiàn)象。2號(hào)和4號(hào)有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。3號(hào)展開(kāi)劑雖然沒(méi)有拖尾，但是對(duì)茯苓中三萜類化合物的分離效果不好。1號(hào)展開(kāi)劑不僅分離出有效成分，而且顯色清晰，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象。最終確定1號(hào)展開(kāi)劑系統(tǒng):三氯甲烷、乙酸乙酯，甲酸三者比例為10∶1∶0.2，為本實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)展開(kāi)劑系統(tǒng)。再次試驗(yàn)，結(jié)論相同。

2.4.5 薄層色譜的圖譜分析與結(jié)論

采用不同提取方法所得提取物與齊墩果酸對(duì)照品均出現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)(在白色底板上，呈淡紫色)，說(shuō)明其中均含有三萜類化合物，定性確定了提取液中三萜類化合物的存在。茯苓提取物薄層色譜分離實(shí)驗(yàn)中的Rf值，均在0.2—0.8范圍內(nèi)。一般來(lái)講，在吸附薄層上物質(zhì)的Rf值與物質(zhì)的極性有關(guān)，極性小的物質(zhì)往往走在前面，Rf值較高;反之極性大的物質(zhì)Rf值較低。從圖中斑點(diǎn)及Rf值可以看出，茯苓在提取物所含成分中Rf值較小，極性較大。本實(shí)驗(yàn)為茯苓三萜類化合物的分析制備、含量測(cè)定及指紋圖譜的研究提供了選擇流動(dòng)相的依據(jù)。

3 結(jié)束語(yǔ)

在本次實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)大量閱讀參考文獻(xiàn)后，確定了實(shí)驗(yàn)的基本思路與方案。選取超聲波提取作為提取茯苓中三萜類化合物的方法，用薄層色譜法作為鑒別方法，紫外/分光光度法作為含量測(cè)定。用正交試驗(yàn)法考察溶劑種類、溶劑用量、提取次數(shù)、提取時(shí)間對(duì)茯苓中三萜類化合物得率的影響，得出:溶劑種類影響最大，其次是提取次數(shù)，最后是溶劑用量。優(yōu)選出最佳提取工藝為20倍量的乙酸乙酯提取三次，每次30 min。本文論點(diǎn)明確，論據(jù)充分切題，實(shí)驗(yàn)方案及技術(shù)路線正確，達(dá)到了預(yù)期的目標(biāo)。為了提取茯苓三萜類化合物，運(yùn)用分光光度法測(cè)定茯苓藥材中三萜類的總量的分析方法，利用香草醛—濃硫酸與三萜類化合物反應(yīng)生成有色化合物的原理，以齊墩果酸為對(duì)照品，對(duì)茯苓中三萜類的物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算茯苓三萜化合物的含量，建立了一種簡(jiǎn)便測(cè)定方法，為茯苓三萜類化合物的分析制備、含量測(cè)定及指紋圖譜的研究提供了選擇流動(dòng)相的依據(jù)。為茯苓的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了一定的參考價(jià)值。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典I部［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:224.

［2］《全國(guó)中草藥匯編》編寫(xiě)組.全國(guó)中草藥匯編(上冊(cè))［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1976:372.

［3］Takaaki Tai，Akira Akahori，Tecsuro Shingu.Triterpenoids from Poria COCOS［J］.Phyto-chemistry，1991，30(8):2796-2797.

［4］Takaaki Tai，AkiraAkahori，Tecsuro Shingu.A lanoscane triterpenoid from Poria COCOS［J］.Phytochemistry，1992，31(7):2548-2549.

［5］Takaaki Tai，Akira Akahori，Tecsuro Shingu.Triterpenes of Poria COCOS［J］.Phytochemistry，1993，32(5):1239-1244.

［6］許先棟，許津，顧惠兒，等.茯苓環(huán)酮雙烯三萜酸的晶體結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)研究［J］.中國(guó)藥物化學(xué)雜志，1994，114(1):23.

［7］Takaaki Tai，Yasuhiko Akita，Kaoru Kinoshita，et al.Anti-emetic principles ofporia COCOS［J］.Planta Med，1995，61(6):527-530.

［8］Takaaki Tai，Tetsuro Shingu，Tohru Kikuchi，et al.Isolation of lanostane·type triterpene acid having an acetoxyl group from sclerotia of poria COCOS［J］.Phytochemistry，1995，40(1):225-231.

［9］Takaaki Tai，Tetsuro Shingu，Tohru Kikuchi，et al.Triterpenes from the surface of Poria COCOS［J］.Phytochemistry，1995，39(5):1165-1169.

［10］王利亞，萬(wàn)惠杰.茯苓有效化學(xué)成份的研究［J］.中草藥，1998，29(3):145-148.

［11］兼松明子，名取信策.Trlterpenoids of hoelen(fuling)，sclerotia ofporia cocos(Schw.)Wolf［J］.1 Yakugaku Zassho，1970，90(4):475-479.

［12］王少軍，段啟，曹君，等.茯苓皮中三萜酸類成分HPLC指紋圖譜的方法學(xué)研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2005，16(1):53-55.