阿托伐他汀對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的干預(yù)作用

馬曄，馬建芳，關(guān)瑞錦

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種炎癥性慢性疾病，炎癥微環(huán)境對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)有顯著影響，并與炎癥細(xì)胞共同參與炎癥過(guò)程[1,2]。新生血管是AS斑塊發(fā)展進(jìn)程中的重要伴隨現(xiàn)象，VEGF作為新生血管形成的中樞調(diào)節(jié)因子，對(duì)其分化成熟及血管形成起著重要的調(diào)控作用。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察AS兔模型血脂和VEGF的表達(dá)以及阿托伐他汀對(duì)其干預(yù)作用的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性新西蘭大白兔20只，（2～3）月齡，體重約（1.3～2.1）kg，清潔級(jí)，購(gòu)自上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)許可證SYXK （軍）2007-031。室溫（18～22）℃，濕度（50±10）%。

1.2主要儀器、試劑盒和藥品兔TC、TG、LDL-C和VEGF ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司）；Biozol Reagent、RNase free ddH2O[BIOER（杭州）]；多聚賴氨酸Sigma；VEGF一抗（武漢基因美）；羊抗兔二抗（invitrogen）（中杉金橋）；BIOZOL總RNA提取試劑、BioRT cDNA 第一鏈合成試劑盒、BioEasy SYBR Green I 熒光PCR試劑盒（杭州博日）；HM315R切片機(jī)（德國(guó)）；PCR儀（ABi美國(guó)）；生物顯微鏡（Nikon Eclipse 55I，彩色數(shù)字CCD）；阿托伐他汀鈣片（輝瑞公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組20只新西蘭雄性大白兔，隨機(jī)平均分為對(duì)照組、模型組、低劑量阿托伐他汀組和高劑量阿托伐他汀組，對(duì)照組采用普通飼料（100g/d）；后三組均采用高脂飼料，配方為普通飼料84%+10%蛋黃粉+1%膽固醇+5%豬油，喂養(yǎng)4W后用球囊損傷腹主動(dòng)脈，模型組不采用任何處理，低劑量阿托伐他汀組采用阿托伐他汀5 mg/（kg.d），高劑量阿托伐他汀組采用阿托伐他汀10 mg/（kg.d）。

1.3.2兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立術(shù)前禁食12小時(shí)并稱重，予硫酸阿托品（0.03 mg/kg）肌肉注射，鹽酸氯氨酮注射液（11.5 mg/kg）聯(lián)合速眠寧Ⅱ（6 mg/kg）麻醉動(dòng)物后，固定四肢和頭部，暴露右股動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)端，近端用絲線阻斷血流，用Terumo corporation橈動(dòng)脈穿刺針成功穿刺股動(dòng)脈后，在DSA透視下送入Runthrough導(dǎo)絲，再沿導(dǎo)絲將（3.0～4.0）mm RuJin球囊導(dǎo)管送至主動(dòng)脈弓處，注入碘普羅胺注射液，加壓（10～18）atm充盈球囊且阻力適中，回拉至髂總動(dòng)脈，反復(fù)回拉3次造成動(dòng)脈內(nèi)膜損傷。

1.3.3血脂及VEGF測(cè)定分別在0W、6W、12W采血5 mL，用ELISA法檢測(cè)血清TG、TC、LDL-C、VEGF水平。12W后空氣栓塞處死實(shí)驗(yàn)兔，自髂動(dòng)脈分叉以上（1～2）cm處至膈肌下1 cm左右處剪下腹主動(dòng)脈，采用Western Blotting檢測(cè)斑塊內(nèi)VEGF蛋白含量，熒光定量PCR檢測(cè)VEGF mRNA的表達(dá)。引物信息：VEGF正向引物5'CGATCGAGACCTTGGTGGACAT 3'反向引物5'TGCATGGTGACGTTGAACTCCT 3'；GAPDH正向引5'ACCCATCACCATCTTCCAGGAG 3'反向引物5'GAAGGGGCGGAGATGATGAC3'。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用PEMS3.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。多組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用SNK－q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

12w后通過(guò)腹主動(dòng)脈血管彩超、血管大體標(biāo)本及血管病理組織學(xué)評(píng)價(jià)兔動(dòng)脈粥樣硬化程度，期間模型組因感染死亡1只，高劑量組因腹瀉死亡1只。

2.1各組兔不同時(shí)間點(diǎn)血脂和VEGF水平分別于第0w、6w和12w檢測(cè)不同組兔血LDL-C、TG、TC和VEGF水平。與對(duì)照組相比，模型組、低劑量他汀組、高劑量他汀組在6w和12w的血LDL-C、TG、TC、VEGF均顯著增高（P＜0.01）。與模型組比較，他汀組血LDL-C、TG、TC、VEGF在第6w和12w明顯降低，但高劑量他汀組降低更為明顯（P＜0.05，表1）。

2.2各組兔動(dòng)脈血管內(nèi)膜病理學(xué)改變對(duì)照組動(dòng)脈內(nèi)皮完整，無(wú)脂質(zhì)沉積；模型組內(nèi)皮增生、增厚，管腔明顯變窄，有大量泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)沉積，中膜變??；他汀組血管內(nèi)膜不同程度增厚和泡沫細(xì)胞形成（圖1）。

2.3各組兔AS斑塊內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，模型組AS斑塊中VEGF的表達(dá)顯著增高（P＜0.01）。與模型組比較，他汀組VEGF在AS斑塊中的表達(dá)均降低。但高劑量他汀組較低劑量他汀組降低更明顯（表1）。

2.4各組兔AS斑塊內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)與對(duì)照組比較，模型組及他汀組VEGF mRNA的表達(dá)水平更高（P＜0.01）。他汀組可降低兔AS斑塊VEGF mRNA的表達(dá)水平（P＜0.05）。與低劑量他汀組比較，高劑量組的效果更為明顯（P＜0.05，表1）。

3 討論

血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素，血漿中的LDL-C是沉積在動(dòng)脈硬化斑塊中的主要脂質(zhì)成分。血管壁內(nèi)及動(dòng)脈粥樣硬化損傷處的細(xì)胞氧化LDL-C產(chǎn)生氧化修飾的LDL-C，后者聚合吞噬細(xì)胞并被其吞噬形成泡沫細(xì)胞以形成脂質(zhì)條紋，進(jìn)一步發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。本研究表明高脂飼料喂養(yǎng)兔在第6w和12w血清TG、LDL-C、TC水平均逐漸顯著增高。

圖1 各組兔動(dòng)脈內(nèi)膜病理學(xué)改變（HE染色，20×；a：對(duì)照組；b：模型組；c：低劑量阿托伐他汀組；d：高劑量阿托伐他汀組）

血管內(nèi)皮在正常情況下能夠防止血栓形成和血小板粘附，調(diào)節(jié)血管的舒縮狀態(tài)，阻礙炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)等。本研究采用球囊損傷血管內(nèi)皮，內(nèi)皮功能異常是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素，而動(dòng)脈粥樣硬化又可加劇內(nèi)皮功能的損傷。采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合球囊損傷血管內(nèi)皮可致血管通透性增加，進(jìn)一步導(dǎo)致大量脂質(zhì)沉積血管內(nèi)膜下，觸發(fā)LDL成OX-LDL。兔腹主動(dòng)脈HE染色可見(jiàn)內(nèi)皮增生、增厚，斑塊隆起，血管管腔明顯變窄，可見(jiàn)許多脂肪空泡，有大量巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等浸潤(rùn)。斑塊表面有纖維組織覆蓋，彈力纖維斷裂、溶解、膠原明顯增生，平滑肌細(xì)胞排列紊亂。中膜變薄，外膜可見(jiàn)毛細(xì)血管增生，具有典型的AS改變，此結(jié)果與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果一致[3-6]。VEGF是一種與血管增殖密切相關(guān)的多肽生長(zhǎng)因子，是最直接的血管內(nèi)皮細(xì)胞促分裂素。AS斑塊中存在多種炎癥介質(zhì)、趨化因子，其共同作用使斑塊中VEGF的表達(dá)上調(diào)[7]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是VEGF主要靶器官，研究表明其在體內(nèi)外均具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、出芽及血管腔形成等功能[8]。且外源性VEGF也可促進(jìn)AS斑塊形成[9]。

表1 不同時(shí)間各組兔血脂和VEGF水平

阿托伐他汀是強(qiáng)效的降脂藥物，除降脂外，他汀類(lèi)藥物在穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、防止血栓形成、改善血管內(nèi)皮功能、抑制血漿炎癥因子等方面均發(fā)揮著重要作用[10,11]。本研究顯示，高劑量和低劑量阿托伐他汀組較模型組血清TG、LDL-C、TG水平顯著降低，動(dòng)脈粥樣硬化病變程度較輕；同時(shí)高劑量阿托伐他汀能更有效降低AS斑塊內(nèi)VEGF mRNA水平。多項(xiàng)研究表明，負(fù)荷劑量的阿托伐他汀在降脂、穩(wěn)定粥樣斑塊、抗炎方面優(yōu)于常規(guī)劑量，并具有劑量依賴關(guān)系[13,14]。阿托伐他汀通過(guò)降低VEGF及相關(guān)蛋白的表達(dá)，延緩甚至逆轉(zhuǎn)AS的進(jìn)展。因此，阿托伐他汀可以減少斑塊內(nèi)血管生成，達(dá)到穩(wěn)定斑塊的作用[15]。ARMYDA-ACS研究[16]正是基于充分應(yīng)用他汀類(lèi)藥物的調(diào)脂外作用的基本理論并獲得明顯效果。

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