短肽RADA16-1自組裝纖維長度與止血關(guān)系研究

李佳楠，鐘小忠，王 婷

（1.江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系，湖北 武漢 430056； 2.成都大學(xué)，四川 成都 610041）

臨床外科手術(shù)止血，尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)外科手術(shù)中如何快速止血是一個難點?？焖僦寡墒沽餮斐傻纳窠?jīng)組織繼發(fā)性損傷降低，減少病人神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。而在之前的研究中，有報道使用自組裝短肽溶液可以在實驗動物不同組織中完成快速止血的現(xiàn)象，完全止血時間小于20 s［1］。該過程未借助壓力，烙燒，血管收縮，凝結(jié)和交聯(lián)附著物（cross-linked adhesives）等傳統(tǒng)的外科止血方法［2-4］。這種快速止血效果對神經(jīng)外科手術(shù)中減少流血對神經(jīng)組織的損傷以及野外急救有著極其重要的意義。并且，已有實驗證明該短肽溶液可以減少中樞神經(jīng)組織急性創(chuàng)傷后的神經(jīng)細胞凋亡（TUNEL法）［5］。

在本研究中，自組裝短肽RADA16-1自組裝形成的長纖維首先通過超聲處理破壞，通過圓二色譜儀、原子力顯微鏡和流變儀研究了自組裝短肽RADA16-1在水溶液中的自組裝動力學(xué)特征。同時，以SD大鼠脊髓全橫斷（T8）和肝臟橫切作為創(chuàng)傷出血模型，統(tǒng)計短肽溶液的止血時間，分析短肽纖維長度及形成的水凝膠的黏度與止血時間的相關(guān)性。該研究可對了解短肽自組裝過程和自組裝短肽止血機理，完善RADA16-1的止血應(yīng)用開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 短肽樣品制備

短肽RADA16-1分子式為RADARADA?RADARADA（RADA16-1），由上海波肽多肽合成實驗室合成和純化（該多肽分子量為1712 ku，純度大于95%）。實驗前短肽RADA16-1用去離子水溶解至終濃度1%，再經(jīng)超聲處理1 min后用0.22 μm的濾膜過濾，無菌分裝室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 圓二色譜（CD）檢測樣品的準(zhǔn)備

將合成的短肽RADA16-1稀釋至終濃度為90 μmol/L（0.15 mg/mL）的肽溶液作為 CD 測試液。光譜掃描范圍190～260 nm，掃描速度10 nm/3 s，所得數(shù)據(jù)用OriginPro 7.0作出譜線。圓二色譜使用的CD儀為AVIV MODEL 400。

1.3 原子力顯微鏡掃描及自組裝分析

使用日本精工SPA400型原子力顯微鏡掃描云母表面上樣品，為DFM模式。所用探針為硅探針，型號是SI-DF20，懸臂長度是200 μm，工作頻率是127 kHz，彈性系數(shù)是12 N/m。掃描采用的分辨率為512×512像素的表面形貌圖和相圖。掃描參數(shù)設(shè)置如下：頻率≈123 kHz，嚙合前抖動振幅≈1V，積分增益0.1～0.3，比例增益0.02～0.1，掃描速度1～2 Hz。

在新揭開的云母表面滴5 μL短肽溶液，15 s后用100 μL去離子水沖洗3次，室溫晾干。取樣點分別是超聲處理前，超聲后2、30、120、240、1440 min。樣品表征后應(yīng)用離線軟件隨機測量每個取樣點圖中15根纖維的長度，計算每個時間點纖維的平均長度。

1.4 材料流變學(xué)分析

樣品黏彈性使用流變儀進行測定（AR2000，TA Instruments），取200 μL短肽溶液樣品放置在流變儀托盤上，使用脂真空密封。在1 Hz恒定頻率時測量水凝膠儲能模量（G′），測試時間為1 min。取樣時間點同原子力顯微鏡表征。

1.5 脊髓損傷止血動物模型

成年SD大鼠，鼠齡17～32天，雌雄不限，由江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。該中心獲得湖北省科學(xué)技術(shù)廳頒發(fā)的《實驗動物使用許可證》（許可證號：syxk（鄂）2012-0042，有效期為2012.3.5-2017.3.4）實驗經(jīng)過江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵守實驗動物處理的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，盡可能減少實驗動物的痛苦及使用數(shù)量。用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，于手術(shù)顯微鏡下在大鼠胸椎T8～T10的位置背側(cè)椎板切除暴露對應(yīng)段位脊髓，使用眼科手術(shù)刀對脊髓T8進行全橫斷，切斷后迅速將1%的不同時間點自組裝短肽溶液50 μL注射入創(chuàng)口，用于創(chuàng)口出血控制，記錄完全止血時間?？瞻讓φ战M以生理鹽水處理。實驗動物每組6只（n=6），實驗組分為：空白對照組，超聲處理前，超聲后2、30、120、240、1440 min組。

1.6 肝創(chuàng)傷止血動物模型

成年SD大鼠，以戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹部去毛備皮，10號手術(shù)刀切開老鼠腹部，暴露肝臟。使用15號手術(shù)刀在最大一葉肝臟切開1 cm長深0.5 cm切口。迅速將1%的不同時間點自組裝短肽溶液200 μL注射入創(chuàng)口，用于創(chuàng)口出血控制，記錄止血時間?？瞻讓φ战M以生理鹽水處理。實驗動物每組6只（n=6），實驗組分為：空白對照組，超聲處理前，超聲后2、30、120、240、1440 min組。

2 結(jié)果

2.1 圓二色譜分析

圓二色譜結(jié)果顯示，超聲前后短肽RA?DA16-1均為明顯的β-折疊構(gòu)象（圖1），提示超聲處理未改變短肽單體分子內(nèi)構(gòu)象，且超聲后β-折疊特征峰（216 nm）的輕微變高顯示更密集的β-折疊聚集，說明超聲處理未破壞短肽RADA16-1單體分子結(jié)構(gòu)。

圖1 自組裝短肽RADA16-1超聲處理前后的圓二色譜（CD）

2.2 自組裝短肽的自組裝過程原子力表征

原子力顯微鏡表征實驗結(jié)果見圖2，結(jié)果表明RADA16-1可以自組裝成長度約（786.34±96.54）nm的長纖維（圖2A）。為研究納米纖維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，RADA16-1水凝膠使用超聲處理1 min，以破壞長纖維。原子力顯微鏡表征顯示，超聲后2 min短肽RADA16-1自組裝形成的長纖維被折斷成平均長度（21.22±5.45）nm的短纖維（圖2B）。隨超聲處理后時間的增加，這些折斷的短纖維具有自組裝能力，最終自組裝成長度約（615.4±103.54）nm的長纖維（圖2F：超聲處理后1440 min）。以上超聲處理后原子力顯微鏡表征實驗重復(fù)3次，3次實驗均得到近似的實驗結(jié)果，折斷的短纖維具有自組裝成長纖維的能力，且該過程可重復(fù)。

圖2 超聲處理前后自組裝短肽RADA16-1的原子力顯微鏡表征圖

2.3 流變力學(xué)分析

該實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。每次實驗中，均可觀察到水凝膠儲能模量（G′）從超聲后2 min的6 Pa上升到超聲后240 min的36.5 Pa，且超聲后1440 min時間點水凝膠的儲能模量（G′）達到50 Pa，結(jié)果見圖3。

圖3 流變力學(xué)分析結(jié)果

RADA16-1動態(tài)自組裝的纖維長度變化和RADA16-1形成的多肽水凝膠的儲能模量統(tǒng)計結(jié)果顯示，自組裝纖維長度和水凝膠儲能模量相關(guān)（P＜0.05）。

2.4 脊髓創(chuàng)傷與肝臟創(chuàng)傷止血實驗

椎板切除后，在胸段T8的位置使用眼科手術(shù)刀對脊髓進行全橫斷，將超聲前以及超聲后不同時間點的50 μL 1%濃度短肽RADA16-1水凝膠滴注進創(chuàng)口，記錄止血時間。超聲前和超聲后1440 min水凝膠樣本可以在20 s內(nèi)完成止血。而對照的生理鹽水組和超聲后2 min實驗組，完全止血時間大于180 s。在肝臟左葉橫切后，使用200 μL 1%濃度的不同時間點水凝膠滴注進創(chuàng)口。超聲前和超聲后1440 min實驗組均在20 s內(nèi)完成止血。而對照的生理鹽水組和超聲后2 min實驗組，完全止血時間大于300 s，結(jié)果見圖4。

圖4 短肽材料止血效果分析

3 討論

已知短肽RADA16-1在水溶液中呈穩(wěn)定的β-折疊結(jié)構(gòu)，β-折疊是RADA16-1能夠自組裝的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。超聲前后的CD檢測顯示溶液中短肽為明顯的β-折疊特征，即短肽RADA16-1的結(jié)構(gòu)未因超聲發(fā)生改變［6］，同時分析CD結(jié)果，發(fā)現(xiàn)超聲后溶液中存在β-折疊聚集的現(xiàn)象，該結(jié)果與Yokoi等［4］的實驗結(jié)果相同，分析原因可能是溶液中RADA16-1單體和超聲折斷的自組裝長纖維通過非共價鍵的自發(fā)聚集行為［7］。

原子力顯微鏡掃描分析顯示自組裝短肽RA?DA16-1形成的納米纖維長度由幾百納米到幾微米之間。超聲后纖維斷裂成長度小于50 nm的短纖維。短纖維重組裝的動力學(xué)在超聲后2、30、120、240、1440min被測定。結(jié)果顯示，纖維的重組裝表現(xiàn)出時間相關(guān)性：到24 h，重組裝形成的纖維長度與原有纖維長度近似，長度（615.4±103.54）nm。重組裝過程中，組裝速度表現(xiàn)出的呈時間相關(guān)的先快后慢的特征，可能是由于超聲后產(chǎn)生的短纖維的濃度效應(yīng)［8］。同時實驗還發(fā)現(xiàn)，重組裝纖維長度的增加與水凝膠流變學(xué)特征的改變呈對應(yīng)關(guān)系。儲能模量隨超聲后時間的增加達到最后G′＞45，相對應(yīng)的自組裝纖維長度達到600 nm，即纖維越長，水凝膠的儲能膜量G′越高。論及實驗基礎(chǔ)。

短肽RADA16-1的完全止血可以在約20 s完成，該過程不同于傳統(tǒng)的止血方式。通過研究短肽RADA16-1的自組裝動力學(xué)過程和分析止血實驗，本研究發(fā)現(xiàn)短肽自組裝成的纖維長度越長，其止血時間越短，可以將短肽RADA16-1溶液止血的機制歸納如下：①超聲將RADA16-1自組裝形成的長纖維打斷成短纖維，而超聲后不同時間點的RADA16-1溶液止血所消耗的時間隨著纖維自組裝增長而縮短。到1440 min止血平均時間約20 s，已經(jīng)接近超聲前RADA16-1完成止血需要的平均時間。②長纖維為水凝膠提供了較高的儲能膜量，使水凝膠更能耐受血液脈搏的壓力［9］。對止血過程進行分析發(fā)現(xiàn)，超聲后早期時間點短纖維止血耗時長，水凝膠的儲能模量低，膠體易碎，會出現(xiàn)血液沖破水凝膠而導(dǎo)致止血失敗的情況。而超聲后1440 min和超聲前的RA?DA16-1在創(chuàng)口內(nèi)形成的水凝膠，均表現(xiàn)出一定的彈性，膠體可隨脈搏出現(xiàn)波動，但無血液沖破水凝膠的情況發(fā)生。③短肽RADA16-1單體含精氨酸和谷氨酸殘基，使短肽自組裝形成的纖維帶電荷，帶電荷的纖維可通過靜電作用與創(chuàng)口很好地黏合［10］。

本實驗對短肽RADA16-1自組裝成長纖維的時間動力學(xué)變化特點及其與止血功能之間的關(guān)系的研究，有助于更好地理解該型短肽的物理化學(xué)特點，為完善RADA16-1的止血應(yīng)用開發(fā)提供理

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