全基因組序列分析——揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展及個體化治療的新途徑

潘映秋，張 偉，陳樞青 綜述

(1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬浙江省臺州醫(yī)院中心實驗室，浙江 臨海 317000;2.浙江大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理與生化藥學(xué)研究所，浙江 杭州 310058)

隨著基因組學(xué)研究的逐漸深入，人們深刻地認(rèn)識到人類疾病除外傷外，幾乎都與基因相關(guān)，研究領(lǐng)域也由有限的遺傳疾病擴大到各種常見疾病。其中，腫瘤是一種非常復(fù)雜的疾病，其復(fù)雜性不僅表現(xiàn)在受多個基因和環(huán)境因素的共同影響，還表現(xiàn)于其存在體細胞基因突變和表觀遺傳調(diào)控改變的逐漸積累的過程，而其改變的機制目前尚不明確。全基因組測序分析有助于解開腫瘤發(fā)生發(fā)展的謎團，為個體化診治腫瘤找到新的思路。

1 體細胞突變與腫瘤

腫瘤細胞基因組中的體細胞突變包含幾種不同類型的DNA 序列的改變:單個堿基的置換;DNA 小片段或者大片段的插入或缺失;基因重排，創(chuàng)建融合基因，破壞DNA，DNA 片段結(jié)合至基因組的其他位置;基因組中某些基因的拷貝數(shù)異常，可較正常二倍體基因組的2個拷貝數(shù)增加或者減少甚至缺失。另外，腫瘤細胞整合外源性DNA 序列。最常見的是整合某些病毒基因，目前已知的可能會導(dǎo)致癌癥發(fā)生的有人類乳頭狀瘤病毒、EB 病毒、乙肝病毒等［1］。Woo 等通過分析400 余種腫瘤基因組的體細胞突變，發(fā)現(xiàn)單堿基突變是最常見的體細胞突變類型，突變主要發(fā)生在細胞分裂S 期，而且腫瘤細胞發(fā)生有義突變的比例較生殖細胞高［2］。Sung 等研究了HBV 整合的復(fù)發(fā)性肝癌的全基因組，發(fā)現(xiàn)HBV 在腫瘤組織中的整合率要遠遠高于癌旁組織，在可能誘發(fā)染色體不穩(wěn)定的HBV 斷點位置拷貝數(shù)變異(copy -number variations，CNVs)顯著增加，而且HBV 整合數(shù)與患者的生存相關(guān)［3］。

遺傳因素和環(huán)境因素共同作用引起的致癌基因的激活以及抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生發(fā)展最常見的肇事突變組合。Stephens 等分析了100個乳腺癌標(biāo)本的體細胞蛋白編碼外顯子基因組的拷貝數(shù)改變和突變情況，發(fā)現(xiàn)某些基因在乳腺癌標(biāo)本中的突變率很高，可能涉及乳腺癌發(fā)生發(fā)展的有近十個關(guān)鍵基因，包括AKT2、ARID1B 和CASP8 等，提示同一種腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能涉及多種致癌基因的共同作用［4］。Kan 等研究了441 種腫瘤樣本的1 507個編碼基因(DNA 堿基數(shù)量約為1 800 Mb)，發(fā)現(xiàn)了2 576個體細胞突變，而且在不同類型或不同亞型的腫瘤中基因的突變率和突變的基因組合均存在差異［5］。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展在很大程度上依賴于關(guān)鍵基因突變所導(dǎo)致的蛋白表達譜的改變，這些異常表達的蛋白可作為新型的腫瘤治療的靶點。近年來，針對異常表達蛋白研發(fā)的單克隆抗體藥物陸續(xù)被開發(fā)并應(yīng)用于臨床，如吉非替尼、特羅凱、伊馬替尼等，有效地延長了腫瘤患者的中位生存期［6］。但在腫瘤治療的過程中，藥物靶蛋白的異源性表達則造成藥物對腫瘤細胞的選擇性下降，導(dǎo)致耐藥及治療的毒副反應(yīng)。Denmeade 等在最近的研究報告中提出了一種新的策略，希望通過選擇性抑制腫瘤細胞中的一種關(guān)鍵內(nèi)源性蛋白肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP 酶(SERCA)的功能來殺傷腫瘤細胞，并據(jù)此研制了前藥G202。該藥為實體瘤血管內(nèi)皮細胞特異性表達的羧前列腺特異性膜抗原(PSMA)耦合SERCA 抑制劑，能特異性地靶向殺傷腫瘤細胞，目前該藥物的I 期臨床試驗已經(jīng)在中晚期癌癥患者中開展［7］。此外，在一些腫瘤中，如急性髓細胞白血病(AML)，通過分析特定異常腫瘤基因的特征，對腫瘤進行分類并制定相應(yīng)的治療方案，不同的亞型具有特異性的基因表達譜、細胞形態(tài)、臨床癥狀和預(yù)后，并由此選擇最優(yōu)的具有針對性的治療方案［8］?？梢娧芯矿w細胞中的基因突變，并通過分析其可能產(chǎn)生的影響尋找到關(guān)鍵突變點，可以促使人類真正地認(rèn)識腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，有助于腫瘤的早期診斷與治療。

2 表觀遺傳學(xué)改變與腫瘤

除了體細胞突變，腫瘤基因組還存在部分導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)和基因表達發(fā)生改變的表觀遺傳學(xué)上的變化，包括DNA 序列的甲基化、組蛋白的乙?；叭ヒ阴；揎?、核小體重塑和RNA 介導(dǎo)的靶向作用的改變等都參與調(diào)控與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的多種生物學(xué)過程［9］。Morin 等研究發(fā)現(xiàn)，近90%的濾泡性淋巴瘤的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶MLL2 發(fā)生了突變［10］，而Haaften 則發(fā)現(xiàn)了12 種不同腫瘤的組織存在組蛋白去甲基化酶UTX 的突變［11］。Berman 等的研究比對了同一個體的腫瘤組織和正常組織的表觀遺傳學(xué)圖譜，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中廣泛存在重要的DNA 甲基化狀態(tài)的改變，該變化可能與基因組后期復(fù)制區(qū)域的核纖層相關(guān)［12］。

新一代測序(next -generation sequencing，NGS)平臺與染色質(zhì)分析技術(shù)，如染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP-Seq)等的結(jié)合，提供了全面的核小體定位、染色質(zhì)構(gòu)象、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和組蛋白及DNA 修飾位點等的信息，使我們對表觀遺傳基因組的特征有了更為深刻的認(rèn)識［13］。近年來隨著質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)儀的靈敏度和準(zhǔn)確度的提升，為表觀遺傳基因組的研究提供了有力的手段。通過新的同位素標(biāo)記法，MS 將有可能提供定量分析的結(jié)果。下一步的研究目標(biāo)將是建立高分辨率的體內(nèi)動態(tài)記錄方法，記錄特定核小體在基因表達過程中的動態(tài)變化［9］。

根據(jù)NGS 平臺目前提供的基因組范圍的CpG 島的甲基化圖譜，有5%～10%的啟動子CpG 島在正常情況下是非甲基化的，而在腫瘤組織中則發(fā)生了異常的甲基化。腫瘤組織中啟動子CpG 島的高度甲基化不僅與蛋白編碼基因的表達有關(guān)，而且與大量的非編碼RNAs 的表達相關(guān)，其中有一部分的甲基化參與了腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移［14］。組蛋白的乙?；饕? 種酶家族的調(diào)控，組蛋白賴氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(KATs)和組蛋白去乙酰化酶(HDACs)，這些酶參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。如實體瘤及惡性血液腫瘤中的p300/CBP 基因的編碼突變涉及了大量的KATs。而且白血病常見的PML-RARa、AML1-ETO 等融合基因則通過招募HDACs 導(dǎo)致異常的基因沉默，從而促進了惡性血液腫瘤的進程［15］。最近研究發(fā)現(xiàn)，近1/3 的嬰幼兒膠質(zhì)母細胞瘤復(fù)制相關(guān)組蛋白H3.3(H3F3A)和H3.1(HIST1H3B)的編碼基因發(fā)生了突變［16］;研究還發(fā)現(xiàn)，H3.3 突變后可能通過延長端粒和影響異染色質(zhì)的穩(wěn)定性參與腫瘤進程［17］。另外，類似的突變也在膠質(zhì)母細胞瘤和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中發(fā)現(xiàn)［18］，提示染色質(zhì)重塑復(fù)合物的突變是惡性腫瘤的共有特征之一。

目前高通量測序平臺能對整個基因組進行序列測定，但是只有2%的序列得以翻譯，而大量未翻譯的“非編碼”RNA(ncRNA)也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用［19］。目前研究較為深入的一個ncRNA:HOTAIR，在乳腺癌和結(jié)直腸癌中異常過表達，通過抑制惡性腫瘤細胞的HOTAIR 表達，可以改變腫瘤細胞的侵襲 力［20，21］。進一步探索與腫瘤相關(guān)的ncRNA 分子機制及其與蛋白之間的相互作用，是染色質(zhì)研究的重要內(nèi)容，將為腫瘤治療提供新的作用靶點［22］。

通過對腫瘤表觀遺傳學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)某些靶點，可以特異性地重新活化因表觀遺傳改變而沉默的抑癌基因，抑制因表觀遺傳改變而活化的致癌基因。目前，DNA 甲基化和HDAC 抑制劑在臨床上應(yīng)用最為廣泛，如5 -氮胞苷和地西他濱用于骨髓增生綜合征的治療［23］，可以有效地激活因啟動子高甲基化而沉默抑癌基因。Landreville 等發(fā)現(xiàn)，抑癌基因BAP1 的失活突變與葡萄膜黑色素瘤(UM)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過高通量篩選出候選化合物進行體內(nèi)外研究，發(fā)現(xiàn)HDAC 抑制劑丙戊酸(VPA)可以抑制UM 細胞在體內(nèi)的生長，提示HDAC 抑制劑可能對UM 具有潛在的治療作用［24］。

盡管目前尚未完全了解腫瘤基因組表觀遺傳學(xué)改變的方式和方法，但是表觀遺傳學(xué)全基因組測序平臺的建立，已經(jīng)成為探秘腫瘤基因組表觀遺傳學(xué)的有力手段。

3 腫瘤基因組的自身比對

對腫瘤基因組進行分析，最關(guān)鍵的是要找出導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的“肇事突變”，因此需要解決的就是如何辨別“肇事突變”和“無關(guān)突變”。以往的基因組研究主要通過比較患者與健康人群間的基因組，統(tǒng)計兩者的某一基因或基因上某一位點的突變率是否存在顯著性差異。但是突變發(fā)生時，DNA 被攻擊的位點幾乎是隨機的，可能發(fā)生在與疾病直接相關(guān)的致命位點，也可能發(fā)生在無關(guān)的序列區(qū)域。研究已發(fā)現(xiàn)，超過20 000個蛋白編碼基因和大量位于內(nèi)含子和DNA 基因間隔區(qū)中的未知功能元件，其中大部分突變都是無關(guān)突變，只有少部分突變與腫瘤相關(guān)，因此如何選擇出最關(guān)鍵的重要突變已經(jīng)成為了目前最大的挑戰(zhàn)［25］。

近年來，大量研究通過比對腫瘤患者的腫瘤組織和自身的正常組織的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)了大量的腫瘤相關(guān)的“肇事基因”。Ley 等提取了一名急性髓細胞性白血病(AML)患者的癌細胞及其健康的皮膚細胞，對兩者之間基因序列進行比對，并進一步與其他患者的SNPs及dbSNPs 進行比較，發(fā)現(xiàn)了體細胞突變所導(dǎo)致的同一個體不同位點基因序列的差異，驗證了病變組織細胞的基因序列在不同個體中的異質(zhì)性，最終找到了可能影響癌癥發(fā)生的8個突變點［26］。Link 等也通過類似的方法比對了一名AML 患者的癌細胞和健康皮膚細胞的全基因組，在該患者的正常皮膚細胞中發(fā)現(xiàn)一個新的雜合的3 千個堿基的缺失，該缺失導(dǎo)致了抑癌基因TP 537 -9 號外顯子的缺失，而在腫瘤細胞中，這部分的缺失則變?yōu)榱思兒献?。此外，他們還在體細胞中發(fā)現(xiàn)了28個蛋白編碼基因的單核苷酸突變體，8個基因結(jié)構(gòu)變異體和12個基因拷貝數(shù)量的改變［27］。Selamat 等通過高通量測序平臺檢測了59 對肺腺癌腫瘤組織和匹配的正常組織的全基因組甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)766個基因存在甲基化狀態(tài)的改變，其中大量甲基化狀態(tài)的改變導(dǎo)致了相關(guān)基因表達水平的差異，并發(fā)現(xiàn)一個可能與肺腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因LGALS4，為進一步研究肺腺癌表觀遺傳調(diào)控相關(guān)的分子機制提供了寶貴的資料，也證明表觀遺傳調(diào)控參與了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過程［28］。Vasmatzis 等通過對16 對匹配的外周T淋巴細胞瘤(PTCL)患者自身組織及6個相關(guān)細胞系的全基因組序列的分析，發(fā)現(xiàn)了13個異?；?，其中5個與p53 相關(guān)［29］。通過對全基因組進行精確的自身比對的測序分析，能夠發(fā)現(xiàn)在常規(guī)檢測中經(jīng)常遺漏的結(jié)構(gòu)性變異株，為研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了有力的幫助。

然而，以未發(fā)生癌變的自身組織作為標(biāo)準(zhǔn)對照是否可靠呢?在個體生命延續(xù)的過程中，各種各樣的突變不可避免，其中有些突變并未導(dǎo)致疾病的發(fā)生，這樣的突變存在于體細胞中，并在細胞分裂時得以延續(xù)。所以即使是看似健康的皮膚細胞也不能認(rèn)為其遺傳基因未發(fā)生任何突變，以此作為對照無疑忽略了這些突變存在的可能性。但目前很難取得更加可靠的DNA 對照信息，為此，如何建立可靠的個體DNA 資料庫成為了迫在眉睫的問題。如果能夠為每一個新生兒建立個體DNA 檔案資料，一次性完成全基因組的序列測定，保存該測序結(jié)果以便將個體不同時期的DNA 進行比對分析，可能是最為可信、高效的一種研究方法。

在過去的30年里，Sanger 測序法是最常用的，是DNA 測序的金標(biāo)準(zhǔn)，但是低通量和高昂的測序成本限制了大規(guī)模、系統(tǒng)性的體細胞全基因組測序工作的開展。2005年，以大規(guī)模并行焦磷酸測序平臺為開端的新一代測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)開創(chuàng)了高通量基因組學(xué)檢測的新時代。大量新型的高通量大規(guī)模并行測序儀器，如羅氏454、SOLiD、Illumina 等測序平臺陸續(xù)被開發(fā)［30］，測序流程逐步簡化，成本則逐步降低。Beckman 公司新近研發(fā)的儀器已經(jīng)將分析所需的DNA 樣本量縮小至納克級。另外，Helico Bioscience 公司的DNA 單分子測序技術(shù)也實現(xiàn)了對樣本的微型化分析［31］。即便如此，由于技術(shù)水平的制約，要獲得一個人完整的全基因組序列成本仍然較高，臨床普及尚待時日。全外顯子組測序是目前應(yīng)用最為廣泛的降低全基因組測序成本的策略之一，僅分析全基因組中最有可能成為肇事突變的2%的編碼蛋白基因組和含有大量疾病相關(guān)突變的部分目標(biāo)基因組。當(dāng)然肇事突變也有很可能會發(fā)生在非編碼區(qū)，因而全基因組測序的比對更為全面。

盡管高通量測序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各種生物學(xué)研究，但是多細胞組織中存在細胞異質(zhì)性，尤其是高異質(zhì)性的腫瘤細胞，除非進行額外的細胞分選實驗，否則腫瘤組織中很難避免正常組織的干擾，難以鑒定出腫瘤發(fā)展中具有重要影響的關(guān)鍵突變。最近，Baslan 等結(jié)合流式分選技術(shù)和高通量測序技術(shù)建立了一種單細胞測序法，實現(xiàn)了對單細胞的拷貝數(shù)變異的比對［32］。Hon 等建立了一種基于多重置換擴增(MDA)的單細胞測序新方法，通過對1 例典型的JAK2 陰性的原發(fā)性血小板增多癥患者的90個單細胞進行了全外顯子測序，分析并揭示了此腫瘤發(fā)生中遵循單克隆演化模型［33］。Xu 等則用同樣的方法研究了1 例腎透明細胞癌，發(fā)現(xiàn)此例腎癌并非由常見的2個突變基因VHL和PBRM1 導(dǎo)致的，這說明在患者群體中所鑒定的頻發(fā)突變可能與腫瘤個體無關(guān)，同時也強調(diào)了在癌癥分析和診斷過程中進行個性化治療的重要性［34］。單細胞測序法解決了之前使用組織樣本測序時無法解決的腫瘤高異質(zhì)性難題，為從單核苷酸水平深入研究癌癥的發(fā)生、發(fā)展機制及其診斷、治療提供了新的研究思路，開辟了新的研究方向。

4 展 望

盡管人們都希望盡快攻克癌癥等常見的復(fù)雜性狀疾病，但是這些復(fù)雜性狀疾病往往是在漫長歲月中發(fā)生發(fā)展起來的，對它們的研究需要對受試人群進行長期跟蹤調(diào)查?？梢灶A(yù)見，在不久的將來全基因組測序的價格將下降到大眾可以接受的水平，建立及應(yīng)用個體DNA 資料庫將不再只是夢想。我們可以將DNA 測序的結(jié)果存儲在服務(wù)器或者光盤中，作為常規(guī)的醫(yī)療檔案，通過比對分析將其用于疾病的診斷、治療，從而發(fā)揮DNA 分子本身的信息性、長期穩(wěn)定性和閱讀備查性。個體DNA 資料庫作為基因組自身比對的物質(zhì)基礎(chǔ)與信息來源，將記錄一個人生老病死的所有秘密。

基因組的自身比對將看清體細胞突變的過程，認(rèn)識到表觀基因組對腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用，大大促進人類對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的認(rèn)識與控制。實踐將證明，基因組自身比對的應(yīng)用與推廣必將成為腫瘤基因組研究的又一次飛躍。

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