雷帕霉素對匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用

張華丹，謝雅聰，翁 靈，張宇辰，史瓊瑤，陳 濤，曾玲暉

(浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310015)

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，我國的癲癇患病率為7 ‰，在最近短短20年時間，我國癲癇患者人數(shù)已升至1 000 萬之多，且每年有將近40 萬的新發(fā)患者。在這些癲癇患者中，兒童和青少年仍是癲癇高發(fā)人群，0～9歲患者占38.5%，10～29歲患者占近40%，且仍有逐年上升趨勢。癲癇患者常伴有注意力分散、學(xué)習(xí)記憶能力減退等認知功能受損的表現(xiàn)，其中學(xué)習(xí)記憶能力減退是癲癇患者認知障礙中最常見的癥狀，嚴(yán)重者可影響工作、學(xué)習(xí)和生活質(zhì)量，給家庭和社會帶來沉重負擔(dān)。認知功能障礙已成為癲癇防治的重點之一［1-3］。

癲癇致學(xué)習(xí)記憶減退的機制已有廣泛研究，目前認為主要是與興奮性遞質(zhì)釋放后導(dǎo)致神經(jīng)元死亡有關(guān)［4-5］。癲癇發(fā)作時可使大腦耗氧量急劇增加，而腦組織幾乎無氧和葡萄糖儲備，并且腦組織對葡萄糖和氧的利用減少，低血糖、缺氧使神經(jīng)元內(nèi)ATP 減少，導(dǎo)致谷氨酸釋放增多和γ-氨基丁酸減少，神經(jīng)元突觸后膜抑制作用減弱，神經(jīng)元過度興奮，突觸后N-甲基-D-天(門)冬氨酸受體激活，引起大量Ca2+流入神經(jīng)元，激活細胞內(nèi)一系列病理過程，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡［6］。

mTOR(mammalian target of rapamycin)是調(diào)控細胞生長增殖和蛋白質(zhì)合成的重要激酶，通過上游和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控細胞生長增殖、基因的翻譯和轉(zhuǎn)錄。在神經(jīng)系統(tǒng)，mTOR信號通路影響神經(jīng)突觸的生長和突觸可塑性的形成，在大腦形成和發(fā)育、神經(jīng)突觸發(fā)生、學(xué)習(xí)和記憶形成中起重要作用，與記憶形成和鞏固有著密切關(guān)系［7-8］。近年來雷帕霉素對于學(xué)習(xí)記憶的作用已有諸多報道，許多研究表明雷帕霉素對一些年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病模型有治療作用，包括阿爾茨海默病、帕金森病以及亨廷頓?。?］。但是對于癲癇所致的學(xué)習(xí)記憶受損有無作用僅國外有零星報道，且均使用SD大鼠或者C57BL6 小鼠［10-12］。

本研究采用匹羅卡品致癇ICR 小鼠，雷帕霉素分別于致癇前后給藥，觀察匹羅卡品致癇小鼠學(xué)習(xí)記憶的改變以及雷帕霉素的作用，并檢測神經(jīng)元死亡和苔蘚纖維發(fā)芽，初步探討mTOR 抑制劑雷帕霉素在匹羅卡品致癇ICR 小鼠學(xué)習(xí)記憶中的作用及可能機制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 冰凍切片機(購自Thermo公司，型號:Microm HM525)、Morris 水迷宮恒溫水池(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)、MG-3Y 迷宮刺激器(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)、大小鼠曠場(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。匹羅卡品、氫溴酸東莨菪堿和阿拉伯膠(Sigma 公司，USA);雷帕霉素(LC Laborotary 公司)。其他試劑均為市售分析純。

1.2 實驗動物 周齡為4～5 周的雄性ICR 小鼠160 只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司(動物許可證號:SYXK(滬)2012-0002)。動物使用嚴(yán)格參照浙江大學(xué)動物管理委員會的規(guī)定執(zhí)行。隨機將小鼠分為5組，分組如下:①溶劑對照組(n=20);②雷帕霉素對照組(n=20);③溶劑模型組(n=40);④雷帕霉素前給藥模型組(n=40);⑤雷帕霉素后給藥模型組(n=40)。其中②與④組在PILO 致癇前腹腔注射3mg/kg 雷帕霉素3 d，1次/d，①、③、⑤組同時注射等體積溶劑;第4天腹腔注射PILO 誘發(fā)急性癲癇發(fā)作，發(fā)作4 級及以上者用于實驗;癲癇持續(xù)發(fā)作2 h 后，用安定終止。急性癲癇發(fā)作后24 h ⑤組注射雷帕霉素3 d，1次/d，同時其它組注射等體積溶劑。其中每組10 只用于Fluo-Jade B 染色，其余用于行為學(xué)和Timm染色。

1.3 急性癲癇的誘發(fā) 小鼠先腹腔注射氫溴酸東莨菪堿0.5mg/kg，用以拮抗匹羅卡品的外周膽堿能反應(yīng)，30min 后腹腔注射匹羅卡品100mg/kg，然后密切觀察小鼠的行為學(xué)變化，發(fā)作4 級及以上者用于實驗。癲癇發(fā)作若未達到4 級，則30min 后補加25%原始劑量的匹羅卡品，使其發(fā)作達到4 級或以上，若補加3次以后，癲癇發(fā)作仍未達到4 級者，則剔除實驗。

癲癇的分級參照1972年Racine［13］制定的標(biāo)準(zhǔn):1 級:靜止不動伴隨有嘴部/面部運動;2級:點頭及落水狗樣抖動;3 級:前肢陣攣;4 級:站立及雙側(cè)前肢陣攣;5 級:持續(xù)站立及跌倒;6 級:狂奔及尖叫。

1.4 Morris 水迷宮 PILO 致癇7～10 d 后進行水迷宮測試［14］。將小鼠置于站臺上，隨后將小鼠隨機從不同象限面壁置入池內(nèi)，小鼠登上站臺10 s 后終止記錄。如此依次將小鼠置入游泳池，每天4次，每次問隔1 h，定位航行訓(xùn)練4 d，第5天測量平臺逃避潛伏期。

1.5 Y 迷宮試驗 參照Feng 等的方法，采用隨機不休息法［15］。對小鼠所在支臂與另一支臂通電，動物在電擊下逃竄至燈光區(qū)后再保持10 s 為一次測試。記憶保持測試:學(xué)習(xí)測試24 h、48 h、1 周、30 d 后，以同樣的方法測試。正確反應(yīng)次數(shù)定為A，以A/10 表示記憶保持能力。

1.6 曠場實驗 抓住小鼠尾根部三分之一處提起，放入曠場實驗箱正中格(50× 50× 50 cm3)，記錄3 min 內(nèi)小鼠穿格次數(shù)。

1.7 Fluro-Jade B(FJB)染色 PILO 致癇后第7天，將小鼠麻醉后，灌流取腦，做冰凍切片。切片用PBS 沖洗，然后依次在1%NaOH/80%酒精溶液浸泡5 min，70%酒精和蒸餾水里各浸泡2 min，0.06%高錳酸鉀溶液浸染10 min，水洗后，置于0.001%FJB 溶液中浸染20 min。封片后在顯微鏡下觀察。

1.8 Timm 染色 PILO 致癇后第30天，小鼠經(jīng)麻醉后，用NaS2灌流取腦。腦組織連續(xù)切片后，在含銀的緩沖液中避光孵育60～80 min，切片水洗10 min 后，封片，在顯微鏡下觀測齒狀回分子細胞層苔蘚纖維發(fā)芽狀況。苔蘚纖維出芽評分標(biāo)準(zhǔn)［16］:0 分:未見Timm 顆粒;1 分:偶見散在的片狀分布的Timm 顆粒;2 分:較多片狀分布的Timm 顆粒;3 分:Timm 顆粒接近連續(xù)分布;4 分:濃密的Timm 顆粒帶，連續(xù)或接近連續(xù)分布;5 分:濃密、層帶狀Timm 顆粒連續(xù)分布。

2 結(jié)果

2.1 匹羅卡品致癇ICR 小鼠的表現(xiàn) 在匹羅卡品注射后5～15 min，小鼠開始出現(xiàn)流誕、立毛、顫抖，同時或先后出現(xiàn)刻板行為如凝視不動、吸鼻、阻嚼或豎尾、濕狗樣震顫、反復(fù)頭頸上仰，隨后出現(xiàn)面肌痙攣、節(jié)律性點頭，40～50 min 時出現(xiàn)反復(fù)單側(cè)或雙側(cè)前肢陣攣、伴直立、跌倒或翻轉(zhuǎn)，部分動物出現(xiàn)驚跳、亂竄、四肢強直-陣攣發(fā)作，開始發(fā)作尚不頻繁，隨著時間的推移，發(fā)作頻率增高。雷帕霉素前給藥組與溶劑組相比，致癇成功率和死亡率無明顯差別(分別為75% vs 68% 和25% vs 32%)，并且在潛伏期、發(fā)作級別、持續(xù)時間上并無明顯差異。

2.2 雷帕霉素可縮短PILO 致癇小鼠Morris 水迷宮的平臺逃避潛伏期 Morris 水迷宮中小鼠平臺逃避潛伏期的結(jié)果見圖1。溶劑對照組及雷帕霉素對照組間無明顯區(qū)別(以下所有實驗中溶劑對照組與雷帕霉素對照組間均無顯著性差異，因此將其合并為對照組)，但模型組小鼠的平臺逃避潛伏期比對照組顯著延長(38.06±19.58 vs 21.27±19.47 s，P＜0.05)，而雷帕霉素致癇前給藥組(16.20±13.15 s，P＜0.001)或后給藥組(21.00±17.25 s，P＜0.05)均較模型組明顯縮短。

圖1 雷帕霉素顯著逆轉(zhuǎn)匹羅卡品所致平臺逃避潛伏期延長Fig.1 Treatment of rapamycin reverses PILOinduced prolongation of avoiding latency

2.3 雷帕霉素增加PILO 致癇小鼠Y 迷宮的正確反應(yīng)次數(shù) Y 迷宮實驗結(jié)果如圖2。與對照組相比，癲癇模型小鼠在Y 迷宮中的正確反應(yīng)次數(shù)顯著減少(4.71±2.42 vs 8.00±2.83，P＜0.01)。前給藥組小鼠比模型組在Y 迷宮中的正確反應(yīng)次數(shù)顯著增加(7.13±2.23 vs 4.71±2.42，P＜0.01)，但后給藥組與模型組的正確反應(yīng)次數(shù)相比并無顯著性差異(5.58±2.27 vs 4.71±2.42，P ＞0.05)。

圖2 雷帕霉素前給藥顯著逆轉(zhuǎn)匹羅卡品所致正確反映次數(shù)減少Fig.2 Pre-treatment of rapamycin reverses PILO-induced decrease in number of correct reaction

2.4 雷帕霉素增加PILO 致癇小鼠曠場實驗中的正確穿格次數(shù) 曠場實驗實驗結(jié)果見圖3。與對照組相比，模型組癲癇小鼠正確穿格次數(shù)明顯減少(121.58±37.32 vs 96.05±37.32，P＜0.05)，前給藥組及后給藥組的正確穿格次數(shù)與模型組相比明顯增加(127.31±27.51 vs 96.05±37.32，P＜0.01;128.33±23.49 vs 96.05±37.32，P＜0.001)。

圖3 雷帕霉素顯著逆轉(zhuǎn)匹羅卡品所致穿格次數(shù)下降Fig.3 Treatment of rapamycin reverses PILOinduced decrease in number of crossing

2.5 PILO 致癇ICR 小鼠未見明顯神經(jīng)元死亡為檢測PILO 致癇后ICR 小鼠海馬神經(jīng)元有無死亡，在致癇后7 d 對小鼠灌流取腦行FJB染色顯示，結(jié)果顯示各組小鼠腦組織切片海馬區(qū)均未見明顯的神經(jīng)元死亡(圖4，顯示海馬CA1 區(qū))。

圖4 各組小鼠均未見明顯神經(jīng)元死亡Fig.4 No apparent neuronal death is detected in all groups

2.6 PILO 致癇ICR 小鼠出現(xiàn)明顯苔蘚纖維發(fā)芽 小鼠經(jīng)行為學(xué)檢測后在，在致癇后30 d 進行Timm 染色，結(jié)果見圖5。模型組與對照組相比，苔蘚纖維發(fā)芽明顯(3.42±0.51 vs 0.25±0.45，P＜0.001)，前后給藥組的苔蘚纖維發(fā)芽情況與模型組相比均明顯減弱(1.33±0.65 vs 3.42±0.51，P＜0.001;2.50±0.52 vs 3.42±0.51，P＜0.001)。

3 討論

本研究采用匹羅卡品致癇ICR 小鼠模型，觀察到:①PILO 致癇后ICR 小鼠雖然并未出現(xiàn)明顯神經(jīng)元細胞死亡，但出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶損傷;②致癇前后給予雷帕霉素治療均能顯著改善PILO 所致的學(xué)習(xí)記憶障礙，且預(yù)防性給藥效果較治療性效果好;③雷帕霉素能明顯抑制PILO 致癇后苔蘚纖維發(fā)芽。這提示雷帕霉素對匹羅卡品致癇導(dǎo)致的ICR 小鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損有保護作用。

圖5 雷帕霉素顯著逆轉(zhuǎn)匹羅卡品所致苔蘚纖維發(fā)芽Fig.5 Treatment of rapamycin reverses PILOinduced mossy fiber sprouting

我們以往的研究以及其他的相關(guān)報道已經(jīng)證實，雷帕霉素可以減少初次腦損傷后自發(fā)性癲癇的發(fā)作，因此，雷帕霉素對致癇小鼠學(xué)習(xí)記憶的保護作用可能與減少自發(fā)性癲癇的發(fā)作相關(guān)［20-23］。在本研究中為降低該可能性，學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)實驗均選擇在致癇后7～10 d 內(nèi)完成，此時自發(fā)性癲癇的發(fā)作頻率低，且持續(xù)時間短，從而自發(fā)性癲癇的發(fā)作對學(xué)習(xí)記憶的影響較少。因此，我們推斷雷帕霉素對致癇小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用與其減少自發(fā)性癲癇無關(guān)。雷帕霉素對PILO 癲癇模型中學(xué)習(xí)記憶的改善作用有待進一步探討。最近有報道表明，癲癇導(dǎo)致的mTOR 信號通路激活可能是造成認知障礙的潛在機制，而雷帕霉素可通過抑制神經(jīng)元及小膠質(zhì)細胞中mTOR 的活性，從而改善癲癇小鼠的記憶學(xué)習(xí)能力［17-19］。

本研究觀察到ICR 小鼠經(jīng)匹羅卡品致癇2 h 后，F(xiàn)JB 染色未觀測到明顯的神經(jīng)元死亡，但可見苔蘚纖維發(fā)芽，雷帕霉素致癇前后給藥均能顯著抑制匹羅卡品致癇小鼠的苔蘚纖維發(fā)芽，與我們以往的研究結(jié)果相吻合［20-21］。有報道表明，PILO 致癇后可見海馬神經(jīng)元死亡［22］，主要機理為顳葉癲癇導(dǎo)致神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中谷氨酸濃度的病理性升高，這種興奮性氨基酸的水平升高會介導(dǎo)和增強氧化應(yīng)激反應(yīng)，而長時間接觸谷氨酸能使神經(jīng)元死亡［23-25］。本實驗中并未見神經(jīng)元死亡，可能與小鼠品系及癲癇發(fā)作時間長短有關(guān)。苔蘚纖維發(fā)芽是自發(fā)性癲癇發(fā)生的病例改變之一，本研究中觀察到雷帕霉素在致癇前后均能減少苔蘚纖維的發(fā)芽，目前正在該模型上對其防治自發(fā)性癲癇的作用進行檢測。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素對于匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇小鼠的學(xué)習(xí)記憶受損有明顯改善，從而為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。雷帕霉素改善癲癇小鼠的學(xué)習(xí)記憶的機制與mTOR 通路抑制有關(guān)，但確切機制還需進一步探討。

［1］MEADOR K J.Cognitive outcomes and predictive factors in epilepsy ［J］.Neurology，2002，58(8 Suppl 5):S21-26.

［2］HOLMES G L.Effects of early seizures on later behavior and epileptogenicity ［J］.Ment Retard Dev Disabil Res Rev，2004，10(2):101-105.

［3］BYARD R W，BLUMBERGS P，RUTTY G，et al.Lack of evidence for a causal relationship between hypoxic-ischemic encephalopathy and subdural hemorrhage in fetal life，infancy，and early childhood［J］.Pediatr Dev Pathol，2007，10(5):348-358.

［4］MENG F J，GUO J，SONG B，et al.Competitive binding of post synaptic density 95 and Ca2 +/ca lmodulin dependent protein kinase II to N-m ethy-l D-aspartate recepto r subun it 2B in rat brain［J］.Acta Pharm aco l Sin，2004，25(2):176-180.

［5］HOLMES G L，YANG Y，LIU Z，et al.Seizureinduced memory impairment is reduced by choline supplementation before or after status epilepticus［J］.Epilepsy Res，2002，48(1-2):3-13.

［6］WASTERLAIN C G，F(xiàn)UJIKAWA D G，PENIX L R，et al.Pathophysiological mechanisms of brain damage from status epilepticus ［J］.Epilepsia，1993，34(S1):S37-S53.

［7］ZENG L H，RENSING N R，WONG M.The mammalian target of rapamycin signaling pathway mediates epileptogenesis in a model of temporal lobe epilepsy［J］.J Neurosci，2009，229(21):6964-6972.

［8］WONG M.Mammalian target of rapamycin(mTOR)inhibition as a potential antiepileptogenic therapy:From tuberous sclerosis to common acquired epilepsies［J］.Epilepsia，2010，51(1):27-36.

［9］LU Zhijie，WANG Wenmin(盧志杰，王文敏).Research advances in Rapamycin against neurodegenerative disease［J］.Drug Eval Res(藥物 評 價 研 究)，2012，35 (2):281-284.(in Chinese)

［10］ERDO ˇGAN F，G?LGELI A，ARMAN F，et al.The effects of pentylenetetrazole-induced status epilepticus on behavior，emotional memory，and learning in rats［J］.Epilepsy Beh，2004，5(3):388-393.

［11］HUANG W，ZHU P J，ZHANG S，et al.mTORC2 controls actin polymerization required for consolidation of long-term memory ［J］.Nat Neurosci，2013，16(4):441-448.

［12］FELICIANO D M，HARTMAN N W，LIN T V，et al.A circuitry and biochemical basis for Tuberous Sclerosis symptoms:From Epilepsy to Neurocognitive deficits［J］.Int J Dev Neurosci，2013，pii:S0736-5748(13)00035-X.

［13］RACINE R J.Modification of seizure activity by electrical stimulation:II.Motor Seizure ［J］.Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32(30):255-310.

［14］SHARMA S，RAKOCZY S，BROWN-BORG H.Assessment of spatial memory in mice ［J］.Life Sci，2010，87(17):521-536.

［15］FENG Ting，LI Feng，SONG Yuehan，et al(馮婷，李 峰，宋月晗，等).Y-maze Improving in the Power of Learning and Memory Research［J］.Prog Mod Biomed(現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展)，2005，14(1):12-14.(in Chinese)

［16］MELLO L E，CAVALHEIRO E A，TAN A M，et al.Circuit mechanisms of seizures in the pilocarpine model of chronic epilepsy:cell loss and mossy fiber sprouting ［J］.Epilepsia，1993，34(6):985-995.

［17］BREWSTER A L，LUGO J N，PATIL V V，et al.Rapamycin Reverses Status Epilepticus-induced Memory Deficits and Dendritic Damage［J］.PloS one，2013，8(3):e57808.

［18］TISCHMEYER W，SCHICKNICK H，KRAUS M，et al.Rapamycin-sensitive signalling in long ‐ term consolidation of auditory cortex ‐ dependent memory［J］.Eur J Neurosci，2003，18(4):942-950.

［19］MAJUMDER S，CACCAMO A，MEDINA D X，et al.Lifelong rapamycin administration ameliorates age‐dependent cognitive deficits by reducing IL‐1β and enhancing NMDA signaling［J］.Aging Cell，2012，11(2):326-335.

［20］CHEN L L，F(xiàn)ENG H F，MAO X X，et al.One hour of pilocarpine-induced status epilepticus is sufficient to develop chronic epilepsy in mice，and is associated with mossy fiber sprouting but not neuronal death［J］.Neurosci Bull，2013，29(3):295-302.

［21］GUO D，ZENG L，BRODY DL，et al.Rapamycin Attenuates the Development of Posttraumatic Epilepsy in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury［J］.PloS one，2013，8(5):e64078.

［22］FUJIKAWA D G.The temporal evolution of neuronal damage from pilocarpine-induced status epilepticus［J］.Brain Res，1996，725(1):11-22.

［23］BENGZON J，MOHAPEL P，EKDAHL CT，et al.Neuronal apoptosis after brief and prolonged seizures［J］.Prog Brain Res，2002，135:111-119.

［24］ZHANG L X，SMITH M A，LI X L，et al.Apoptosis of hippocampal neurons after amygdala kindled seizures［J］.Brain Res Mol Brain Res，1998，55(2):198-208.

［25］MANDIC A，VIKTORSSON K，STRANDBERG L，et al.Calpaln-mediated Bid eleavage and calpainindependent Bak modulation:T wo separate pathways in cisplatin-nduced apoptosis ［J］.Mol Cell Biol，2002，22(9):3003-3013.