雷帕霉素對兔眼準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)后haze的影響

于 睿,高洪蓮,李欣蒙,劉奇奇,張 磊

0引言

在過去的30a里，近視的發(fā)病率顯著增加，預(yù)計到2050年，全球?qū)⒂幸话氲娜丝诎l(fā)展為近視[1]。屈光手術(shù)有著很大的臨床需求，而準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)(photorefractive keratectomy，PRK)經(jīng)過不斷地改良和完善，以其安全高效、術(shù)后角膜生物力學(xué)穩(wěn)定和無角膜瓣并發(fā)癥風(fēng)險等優(yōu)勢目前仍在廣泛應(yīng)用[2-4]。角膜上皮下霧狀混濁(haze)是PRK術(shù)后最常見的并發(fā)癥，會引起屈光回退、眩光和對比敏感度下降等問題。目前臨床中常用于控制haze的藥物包括糖皮質(zhì)激素、抗代謝藥物、非甾體類抗炎藥等，上述藥物主要通過抗炎與抗凋亡途徑來抑制haze，但存在繼發(fā)激素性高眼壓、淺層點狀角膜炎和角膜內(nèi)皮毒性損害等不良反應(yīng)的可能[5]。haze是由于基質(zhì)重建過程中膠原纖維生成與降解的失衡，引起膠原纖維排列紊亂導(dǎo)致的，目前有研究表明調(diào)節(jié)自噬活性可以抑制組織的纖維化程度[6-8]。雷帕霉素(rapamycin)屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，也是一種自噬激活劑，有研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以抑制mTOR通路，增強(qiáng)細(xì)胞自噬活性，進(jìn)而抑制腎臟、心肌等組織纖維化程度[9-12]。本研究擬通過建立兔眼PRK手術(shù)模型，術(shù)后給予雷帕霉素滴眼液治療，觀察其對角膜haze形成的影響，并初步分析自噬因子及相關(guān)凋亡基因的表達(dá)情況。

1材料和方法

1.1材料實驗動物：健康普通級新西蘭大白兔80只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5kg，購于濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心，入組前篩查排除無眼部疾病。實驗動物的喂養(yǎng)和使用遵循濱州醫(yī)學(xué)院動物管理委員會相關(guān)規(guī)定。本研究方案經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會審批。主要試劑：DMSO(北京索萊寶生物科技有限公司)；雷帕霉素(MedChemExpress公司)；小鼠增強(qiáng)聚合物法檢測系統(tǒng)(北京中杉金橋生物科技有限公司)；鼠源性轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(英國Abcam公司)；DAB顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；動物組織總RNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量PCR試劑盒(美國Roche公司)。主要儀器：準(zhǔn)分子激光儀VISX STAR S4(美國AMO公司)；裂隙燈顯微鏡(瑞士Haag-Streit公司，BQ-900)。

1.2方法

1.2.1兔PRK模型的制作和分組將80只新西蘭大白兔采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、單純手術(shù)組、14μmol/L 二甲基亞砜(DMSO)組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組,各16只，均取右眼為實驗眼。單純手術(shù)組、14μmol/L DMSO組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組術(shù)前3d給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%氧氟沙星眼膏點眼預(yù)防感染，術(shù)前耳緣靜脈注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)進(jìn)行全身麻醉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液行眼表麻醉，準(zhǔn)分子激光系統(tǒng)下行PRK手術(shù)；激光參數(shù)：準(zhǔn)分子激光治療性角膜切削術(shù)(phototherapeutic keratectomy，PTK)模式去除角膜上皮，能量設(shè)置160mJ/cm2，切削深度120μm，光學(xué)區(qū)切削直徑6.0mm。術(shù)后平衡鹽水沖洗，配戴軟性角膜接觸鏡，術(shù)后每天3次質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%氧氟沙星眼膏涂眼，預(yù)防感染。

1.2.2雷帕霉素滴眼液的配制及給藥方式DMSO助溶雷帕霉素，配制為100mmol/L的雷帕霉素母液，無菌操作下用生理鹽水稀釋為50μmol/L和100μmol/L的雷帕霉素滴眼液，DMSO終濃度為0.1%。14μmol/L DMSO組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組分別應(yīng)用14μmol/L DMSO、50μmol/L雷帕霉素和100μmol/L雷帕霉素點眼，每天3次，每次1滴，連續(xù)給藥7d，單純手術(shù)組只行PRK手術(shù)，正常對照組不做任何處理。

1.2.3術(shù)后角膜上皮愈合時間及haze分級術(shù)后每日觀察實驗眼有無感染發(fā)生以及角膜上皮的愈合情況，記錄并進(jìn)行比較。術(shù)后1、4wk進(jìn)行haze分級。采用Fantes的分級標(biāo)準(zhǔn)：角膜透明為0級；裂隙燈下仔細(xì)觀察可見角膜細(xì)微混濁為1級；易觀察到輕度混濁為2級；中度混濁，影響觀察虹膜結(jié)構(gòu)為3級；重度混濁，遮擋眼內(nèi)結(jié)構(gòu)為4級[13]。

1.2.4標(biāo)本采集及石蠟切片制作術(shù)后1、4wk各組分別任意選取8只新西蘭大白兔，采用空氣栓塞法處死，處死后迅速取實驗眼角膜，其中4只角膜放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、透明和石蠟包埋后，制成4μm石蠟切片；另外4只放入-80℃冰箱凍存進(jìn)行PCR。

1.2.5免疫組化檢測α-SMA和TGF-β1及MMP-2的表達(dá)石蠟切片烤片，脫蠟，高壓抗原修復(fù)，封閉液封閉30min，一抗分別滴加小鼠抗兔α-SMA(1∶100)、TGF-β1(1∶50)、MMP-2(1∶100)，4℃孵育過夜，滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，滴加增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠IgG聚合物，DAB顯色(出現(xiàn)棕黃色即為陽性)，蘇木素復(fù)染1min，經(jīng)脫水、透明后用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。光學(xué)顯微鏡下觀察各標(biāo)本，400倍鏡下每張切片任意選取3個視野，通過Image Pro Plus 6.0圖像處理分析軟件分析各組染色區(qū)的吸光度(A)值。

1.2.6RealTimePCR法檢測ATG5和ATG12與Bcl-2及Caspase3的mRNA表達(dá)水平將角膜置于冰上研磨，用動物組織總RNA提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計測定提取RNA的濃度；根據(jù)NCBI提供的基因序列，由Takara合成引物序列(表1)。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA；以GAPDH為內(nèi)參。按2×SYBR Green qPCR Mix說明書設(shè)置PCR反應(yīng)條件，記錄CT值，使用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

表1 引物序列

2結(jié)果

2.1各組兔眼術(shù)后角膜上皮愈合時間的比較術(shù)后每天用手持裂隙燈觀察兔角膜愈合情況，各組角膜上皮均在術(shù)后3～4d內(nèi)愈合。單純手術(shù)組、14μmol/L DMSO組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組術(shù)后角膜上皮愈合時間分別為3.44±0.51、3.50±0.52、3.38±0.50、

3.25±0.45d，各組兔眼術(shù)后角膜上皮愈合時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.745，P=0.530)。

2.2各組兔眼術(shù)后haze分級比較正常對照組無haze形成。單純手術(shù)組、14μmol/L DMSO組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組均在術(shù)后1wk出現(xiàn)不同程度haze，術(shù)后4wk時haze癥狀最重。術(shù)后1、4wk，單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組haze癥狀均較嚴(yán)重，其次為50μmol/L雷帕霉素組，100μmol/L雷帕霉素組haze癥狀較其他組明顯減輕(圖1)。各組不同時間點haze分級的比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其中50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組haze分級較單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組明顯降低，100μmol/L雷帕霉素組haze分級較50μmol/L雷帕霉素組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組haze分級比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

圖1 裂隙燈顯微鏡觀察各組兔眼不同時間點haze情況 A：1wk后正常對照組；B：術(shù)后1wk單純手術(shù)組；C：術(shù)后1wk 14μmol/L DMSO組；D：術(shù)后1wk 50μmol/L雷帕霉素組；E：術(shù)后1wk 100μmol/L雷帕霉素組；F：4wk后正常對照組；G：術(shù)后4wk單純手術(shù)組；H：術(shù)后4wk 14μmol/L DMSO組；I：術(shù)后4wk 50μmol/L雷帕霉素組；J：術(shù)后4wk 100μmol/L雷帕霉素組。

表2 PRK術(shù)后不同時間點各組haze分級比較 級)

2.3各組兔角膜TGF-β1和MMP-2及α-SMA的表達(dá)正常對照組角膜中表達(dá)微量MMP-2，無α-SMA和TGF-β1表達(dá)。PRK術(shù)后1wk，各組均出現(xiàn)TGF-β1、MMP-2、α-SMA表達(dá)，在50、100μmol/L雷帕霉素組中表達(dá)呈弱陽性，在單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組中呈中等陽性；PRK術(shù)后4wk，各組TGF-β1、MMP-2、α-SMA表達(dá)均增強(qiáng)(圖2～4)。各組兔眼不同時間點TGF-β1、MMP-2、α-SMA 3種因子平均A值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，其中術(shù)后各時間點50、100μmol/L雷帕霉素組TGF-β1、MMP-2、α-SMA 3種因子平均A值均較單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組明顯降低；100μmol/L雷帕霉素組TGF-β1、MMP-2、α-SMA 3種因子平均A值較50μmol/L雷帕霉素組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；單純手術(shù)組、14μmol/L DMSO組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組MMP-2因子平均A值較正常對照組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組TGF-β1、α-SMA 平均A值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3、4。

表3 各組兔眼術(shù)后不同時間點角膜中TGF-β1和α-SMA表達(dá)的比較

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測角膜中TGF-β1情況(DAB) A：1wk后正常對照組；B：術(shù)后1wk單純手術(shù)組；C：術(shù)后1wk 14μmol/L DMSO組；D：術(shù)后1wk 50μmol/L雷帕霉素組；E：術(shù)后1wk 100μmol/L雷帕霉素組；F：4wk后正常對照組；G：術(shù)后4wk單純手術(shù)組；H：術(shù)后4wk 14μmol/L DMSO組；I：術(shù)后4wk 50μmol/L雷帕霉素組；J：術(shù)后4wk 100μmol/L雷帕霉素組。

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測角膜中MMP-2情況(DAB) A：1wk后正常對照組；B：術(shù)后1wk單純手術(shù)組；C：術(shù)后1wk 14μmol/L DMSO組；D：術(shù)后1wk 50μmol/L雷帕霉素組；E：術(shù)后1wk 100μmol/L雷帕霉素組；F：4wk后正常對照組；G：術(shù)后4wk單純手術(shù)組；H：術(shù)后4wk 14μmol/L DMSO組；I：術(shù)后4wk 50μmol/L雷帕霉素組；J：術(shù)后4wk 100μmol/L雷帕霉素組。

2.4RT-PCR檢測結(jié)果各組不同時間點ATG5、ATG12、Bcl-2和Caspase3 mRNA相對表達(dá)量的比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其中單純手術(shù)組、14μmol/L DMSO組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組ATG5、ATG12、Caspase3 mRNA相對表達(dá)量較正常對照組升高，Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量較正常對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組ATG5、ATG12、Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量較單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組明顯升高，Caspase3 mRNA相對表達(dá)量較單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；100μmol/L雷帕霉素組ATG5、ATG12、Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量較50μmol/L雷帕霉素組明顯升高，Caspase3 mRNA相對表達(dá)量較50μmol/L雷帕霉素組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組ATG5、ATG12、Bcl-2和Caspase3 mRNA相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表5 各組不同時間點ATG5、ATG12、Bcl-2、Caspase3 mRNA相對表達(dá)量

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測角膜中α-SMA情況(DAB) A：1wk后正常對照組；B：術(shù)后1wk單純手術(shù)組；C：術(shù)后1wk 14μmol/L DMSO組；D：術(shù)后1wk 50μmol/L雷帕霉素組；E：術(shù)后1wk 100μmol/L雷帕霉素組；F：4wk后正常對照組；G：術(shù)后4wk單純手術(shù)組；H：術(shù)后4wk 14μmol/L DMSO組；I：術(shù)后4wk 50μmol/L雷帕霉素組；J：術(shù)后4wk 100μmol/L雷帕霉素組。

表4 各組兔眼術(shù)后不同時間點角膜中MMP-2表達(dá)的比較

3討論

PRK后haze形成的過程就是一個角膜創(chuàng)傷過度愈合的過程，這一過程開始于角膜壞死細(xì)胞的清除[14-15]。基質(zhì)損傷后，細(xì)胞因子的釋放誘導(dǎo)角膜基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡，并刺激鄰近細(xì)胞增殖和遷移[16]。角膜基質(zhì)細(xì)胞在TGF-β1等因子作用下轉(zhuǎn)化為角膜成纖維細(xì)胞，分化為角膜肌成纖維細(xì)胞，TGF-β1是調(diào)控分化的關(guān)鍵因子。肌成纖維細(xì)胞可特征性地表達(dá)α-SMA，導(dǎo)致膠原纖維排列紊亂。MMPs是Ⅳ型膠原蛋白水解酶，能降解基質(zhì)中的主要骨架。重建基質(zhì)過程中產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)可以促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的生成，產(chǎn)生粗大膠原纖維，這種降解與生成的失衡導(dǎo)致膠原纖維排列紊亂，從而形成了haze[4,17]。Milani等[18]研究表明應(yīng)用雷帕霉素后可以抑制α-SMA和TGF-β1的表達(dá)；在本研究中發(fā)現(xiàn)，PRK術(shù)后每日裂隙燈顯微鏡下觀察50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組haze嚴(yán)重程度較其他手術(shù)組明顯減輕，術(shù)后1、4wk TGF-β1、MMP-2、α-SMA的表達(dá)與各組haze嚴(yán)重程度相同，說明術(shù)后應(yīng)用雷帕霉素可以減輕TGF-β1、MMP-2、α-SMA的表達(dá)，抑制haze的形成。

自噬(autophagy)是一種通過溶酶體對細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行精心安排、自我調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)降解機(jī)制，既往許多研究表明自噬對細(xì)胞的正常穩(wěn)態(tài)和健康功能至關(guān)重要[19]。自噬是由兩大類信號分子調(diào)控，包括mTOR依賴通路和非mTOR依賴通路，其中前者是主要通路。mTOR是高度保守的Ser/Thr蛋白激酶復(fù)合物，調(diào)控細(xì)胞生長、存活和代謝。此外，mTOR可以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成[20]，抑制蛋白質(zhì)分解代謝，并通過調(diào)節(jié)自噬和凋亡水平[21]來促進(jìn)細(xì)胞生長發(fā)育過程。參與自噬的基因被稱為自噬相關(guān)基因(ATGs)，目前已鑒定出12個ATGs，ATGs的表達(dá)水平可以反映自噬的活性,并通過ATG12～ATG5和ATG8(LC3)-PE(磷脂酰乙醇胺)系統(tǒng)[22]調(diào)控自噬體的形成。雷帕霉素可以與mTOR受體結(jié)合，抑制mTOR發(fā)揮作用，是一種典型的mTOR通路抑制劑，也是自噬激活劑。Lin等[23]研究表明應(yīng)用雷帕霉素后可以通過誘導(dǎo)自噬去降低纖維化水平；在本研究中發(fā)現(xiàn)，50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組的ATG5和ATG12 mRNA相對表達(dá)量較單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組明顯上調(diào)，提示自噬增強(qiáng)，且角膜纖維化程度較單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組明顯減輕。細(xì)胞凋亡是程序性的細(xì)胞死亡，是消除功能失調(diào)或受損細(xì)胞的生理過程[24]。Caspase家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，它的級聯(lián)激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2調(diào)控Caspase的激活。Lin等[23]研究表明應(yīng)用雷帕霉素后可以降低細(xì)胞凋亡水平；在本研究中發(fā)現(xiàn)，50、100μmol/L雷帕霉素組的Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量較單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組明顯上調(diào)，Caspase3 mRNA的相對表達(dá)量較單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組明顯下調(diào)，提示凋亡水平受到抑制，且角膜纖維化程度較單純手術(shù)組和14μmol/L DMSO組明顯減輕。在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)100μmol/L雷帕霉素組自噬活性高于50μmol/L雷帕霉素組，且對haze的抑制程度最強(qiáng)，提示雷帕霉素對PRK術(shù)后haze的抑制程度可能存在濃度依賴性。

正常情況下角膜組織中的細(xì)胞自噬和凋亡水平處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，當(dāng)受到創(chuàng)傷或感染時，不同信號調(diào)節(jié)通路可能通過激活或抑制自噬來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[25]。本研究結(jié)果顯示，兔眼PRK術(shù)后應(yīng)用雷帕霉素，自噬水平增加，凋亡水平受到抑制，haze形成也受到抑制，提示雷帕霉素可能通過調(diào)節(jié)自噬活性來抑制haze的形成。但是，雷帕霉素的給藥濃度界限需要進(jìn)一步的實驗進(jìn)行明確，我們會在接下來的實驗中進(jìn)行進(jìn)一步研究。