宛氏擬青霉提取物誘導(dǎo)小白菜抗低溫脅迫的作用機(jī)理

王慶彬 劉治國(guó) 彭春娥 孟 慧 趙紅玲 王洪鳳 張 民

(1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/土肥資源高效利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；2 山東蓬勃生物科技有限公司，山東 泰安 271018；3 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；4 山東蓬創(chuàng)農(nóng)業(yè)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，山東 泰安 271018)

低溫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因素之一。近年來(lái)，極端氣候頻發(fā)，倒春寒和寒露風(fēng)等低溫災(zāi)害逐年增加[1]。低溫脅迫導(dǎo)致植物膜脂過(guò)氧化、細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形、DNA損傷、蛋白質(zhì)降解和生理代謝紊亂[2]，最終導(dǎo)致植物生長(zhǎng)緩慢和葉片邊緣干燥，植株變色、枯萎、甚至死亡[3]，嚴(yán)重影響蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。過(guò)氧化氫(H2O2)在低溫脅迫中一方面作為一種信號(hào)因子，誘導(dǎo)作物體內(nèi)抗氧化酶的活性[5]，但另一方面過(guò)量積累的H2O2會(huì)導(dǎo)致丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加，MDA積累越多，說(shuō)明細(xì)胞膜受到的氧化損傷越重[6]。前人研究表明，冷害脅迫下，植物通過(guò)提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)等抗氧化酶活性進(jìn)而加速活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的清除，以減輕氧化損傷[7]；通過(guò)提高低溫響應(yīng)途徑[inducer of C-repeat-binding factor(CBF)expression(ICE)]誘導(dǎo)CBF啟動(dòng)冷響應(yīng)基因(cold-responsive genes，COR)中相關(guān)基因的表達(dá)[8]，來(lái)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[9]；通過(guò)調(diào)控內(nèi)源激素的含量[10]，從而解除低溫對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。

小白菜(BrassicachinensisL.)又稱不結(jié)球白菜、青菜，質(zhì)地鮮嫩，富含礦物質(zhì)和維生素，在我國(guó)、東南亞、日、美、歐洲等國(guó)家和地區(qū)廣泛栽培和食用[11]。其中，春茬小白菜的經(jīng)濟(jì)效益最好，但品質(zhì)和產(chǎn)量容易受到冬、春季低溫的影響[12]。因此，提高冬、春季小白菜的耐寒性具有重要的研究意義。

前人研究發(fā)現(xiàn)外源施加100 μmol·L-1脫落酸[13]、1.25 mL·L-1殼寡糖[14]、1 mmol·L-1乙酰水楊酸[15]或4 mL·L-1多胺[16]等均可以增加低溫脅迫下植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，提高抗氧化酶的活性，加速ROS的清除，在一定程度提高植物的抗寒性，但鮮見(jiàn)外源類物質(zhì)在緩解小白菜低溫脅迫方面的報(bào)道。前期研究表明，宛氏擬青霉提取物，又名“智能聰”(Zhi Neng Cong，ZNC)是一種活性極高的新型生物刺激素，提取自野生沙棘內(nèi)生宛氏擬青霉菌菌絲體(菌種保藏號(hào)：CGMCCNO.10114)，其主要成分包括小分子寡糖、氨基酸、嘧啶核苷、糖蛋白、多肽等促生物質(zhì)[17]，安全性高[18]，在促進(jìn)作物生長(zhǎng)[19]、提高作物抗病[20]、抗逆性[21]、增加作物產(chǎn)量和品質(zhì)[17]等方面具有顯著作用。王曉琪等[22]研究發(fā)現(xiàn)，低溫下使用0.1 μg·L-1ZNC就能有效提高水稻抗氧化酶活性，降低MDA含量，提高光合速率，緩解水稻受到的低溫脅迫，使用濃度僅為腐殖酸、海藻提取物、聚谷氨酸等外源物質(zhì)的1/40 000 000～1/260 000。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)小白菜葉片噴施不同濃度ZNC，探究ZNC對(duì)低溫脅迫下小白菜生長(zhǎng)的影響，以期為降低低溫對(duì)蔬菜的危害提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試ZNC由山東蓬勃生物科技有限公司提供；供試小白菜品種為黃秧小白菜，購(gòu)自江西省玉豐種業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在山東蓬勃生物科技有限公司人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。小白菜種子用5%的次氯酸鈉消毒5 min，充分震蕩，再用無(wú)菌水沖洗干凈，然后置于4℃冰箱中春化2 d。播種前先將蛭石滅菌，充分混勻裝入花盆，表面平整，放入托盤(pán)，托盤(pán)底部緩慢加入1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液至花盆內(nèi)蛭石表面濕潤(rùn)。然后選取飽滿的小白菜種子于2019年10月9日均勻播撒到花盆中，每盆4粒，埋深0.5 cm，每個(gè)處理5盆，于光照培養(yǎng)室(溫度22℃，光照強(qiáng)度80 μmol·m-2·s-1，光照12 h，黑暗12 h)內(nèi)培養(yǎng)至幼苗長(zhǎng)至4片真葉。2019年11月29日進(jìn)行5種不同處理，包括4個(gè)4℃低溫處理：Z0(葉噴清水)、Z1(葉噴20 ng·mL-1ZNC)、Z2(葉噴30 ng·mL-1ZNC)、Z3(葉噴40 ng·mL-1ZNC)，以及1個(gè)22℃常溫處理(CK)。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，使用50 mL噴壺對(duì)每個(gè)處理噴20 mL對(duì)應(yīng)濃度的ZNC或清水，待葉片表面無(wú)水跡后進(jìn)行低溫處理，處理4 d后取樣進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 SPAD值、小白菜株高、地上部鮮重測(cè)定 低溫處理4 d后，每個(gè)處理選取20株大小均勻的小白菜，用SPAD-502 PLUS植物葉綠素儀(日本KONICA MINOLTA公司)測(cè)量SPAD值，用游標(biāo)卡尺(德國(guó)Meinaite公司)測(cè)量根莖基部到葉片最頂端的株高，切除根部，用萬(wàn)分之一天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)稱量地上部鮮重。

1.3.2 小白菜葉片H2O2含量和MDA含量測(cè)定 稱取0.5 g不同處理小白菜新鮮葉片，參考Velikova等[23]的方法測(cè)定H2O2含量，使用硫代巴比妥酸法[24]測(cè)定MDA含量。

1.3.3 小白菜葉片抗氧化酶活性測(cè)定 稱取0.5 g不同處理小白菜新鮮葉片，使用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定鮮樣小白菜葉片SOD活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性，采用紫外分光光度法測(cè)定CAT活性[25]。

1.3.4 小白菜葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測(cè)定 稱取0.5 g不同處理小白菜新鮮葉片，采用茚三酮比色法測(cè)定鮮樣小白菜葉片游離脯氨酸含量，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白含量[26]。

1.3.5 抗寒相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè) 取不同處理小白菜的第3片功能葉，液氮研磨，保存于-80℃環(huán)境。稱取100 mg樣品使用Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(杭州博日科技股份有限公司)提取葉片總RNA，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)說(shuō)明書(shū)的試驗(yàn)步驟合成cDNA第一鏈。參考文獻(xiàn)[27]獲得小白菜內(nèi)參基因及冷調(diào)控相關(guān)基因BrICE1、BrCBF、BrCOR14的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)引物序列(表1)，引物由上海生工生物科技有限公司合成。以cDNA第一鏈為模板，使用MonAmpTMFast SYBR?Green qPCR Mix試劑(蘇州莫納生物科技有限公司)，在CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Red公司)上進(jìn)行目標(biāo)基因表達(dá)水平的檢測(cè)。qRT-PCR程序按照MonAmpTMFast SYBR?Green qPCR Mix使用說(shuō)明設(shè)置。試驗(yàn)共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt方法[28]計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.6 小白菜葉片激素含量測(cè)定 使用高效液相色譜-20A(SHIMADZU公司，日本)測(cè)定吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)、赤霉素(gibberellic acid，GA)、水楊酸(salicylic acid，SA)和脫落酸(abscisic acid，ABA)的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，SPSS 22進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度ZNC對(duì)低溫脅迫下小白菜株高及地上部鮮重的影響

由表2可知，低溫脅迫影響小白菜光合色素含量，抑制小白菜生長(zhǎng)，與CK相比，低溫處理(Z0)小白菜葉片SPAD值降低26.02%，株高降低17.26%，地上部鮮重降低29.48%。而噴施不同濃度ZNC處理的Z1、Z2、Z3，SPAD值較Z0分別顯著上升17.50%、19.50%、22.31%；株高升高6.44%、10.47%、10.13%；地上部鮮重顯著升高20.69%、27.59%、26.72%。說(shuō)明不同濃度ZNC處理均能顯著增加低溫脅迫下光合色素含量，提高小白菜株高和地上部鮮重。

表2 低溫脅迫下ZNC處理對(duì)小白菜SPAD值及生物量的影響Table 2 Effects of ZNC on the SPAD and biomass in pakchoi under cold stress

2.2 不同濃度ZNC對(duì)低溫脅迫下小白菜抗氧化酶活性的影響

由圖1可知，與CK相比，低溫脅迫(Z0)下小白菜的SOD活性提高31.07%，POD和CAT活性分別降低16.34%和17.44%；而低溫脅迫下噴施不同濃度ZNC均顯著提高了小白菜SOD、POD和CAT的活性，其中SOD活性分別提高24.58%、29.41%、25.29%，POD活性分別提高66.89%、69.37%、80.52%，CAT活性分別提高140.83%、153.48%、162.34%。表明ZNC可通過(guò)提高低溫下抗氧化酶活性加速小白菜活性氧的清除。

注：不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level among treatments. The same as following．圖1 低溫脅迫下ZNC處理對(duì)小白菜抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of ZNC on the autioxidant enzyme activities in pakchoi under cold stress

2.3 不同濃度ZNC對(duì)低溫脅迫下小白菜H2O2和MDA含量的影響

由圖2可知，與CK相比，Z0小白菜的H2O2和MDA含量顯著升高52.05%和68.43%，說(shuō)明低溫脅迫下小白菜細(xì)胞膜正在遭受氧化損傷。Z1、Z2和Z3的H2O2含量分別較Z0顯著降低17.90%、23.69%、21.06%，MDA含量分別顯著降低19.95%、28.07%、28.91%，說(shuō)明葉噴ZNC能夠通過(guò)降低H2O2和MDA的積累緩解低溫導(dǎo)致的白菜細(xì)胞膜氧化損傷。

圖2 低溫脅迫下ZNC處理對(duì)小白菜H2O2和MDA含量的影響Fig.2 Effects of ZNC on the H2O2 and MDA content in pakchoi under cold stress

2.4 不同濃度ZNC對(duì)低溫脅迫下小白菜冷調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖3可知，低溫脅迫(Z0)處理4 d后BrICE1基因無(wú)顯著變化，但BrCOR14和BrCBF基因的相對(duì)表達(dá)量分別較CK顯著上調(diào)114.43和22.13倍。噴施不同高濃度ZNC后，Z1、Z2和Z3小白菜BrICE1基因的相對(duì)表達(dá)量較Z0仍無(wú)顯著變化，但BrCOR14和BrCBF基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步提高，BrCOR14的相對(duì)表達(dá)量分別提高42.56%、49.31%和56.81%，BrCBF的相對(duì)表達(dá)量分別提高21.98%、33.13%和28.09%。說(shuō)明低溫處理下ZNC通過(guò)提高冷調(diào)控相關(guān)基因BrCOR14和BrCBF的表達(dá)使小白菜抗寒性增強(qiáng)。

圖3 低溫脅迫下ZNC處理對(duì)小白菜冷調(diào)控相關(guān)基因的影響Fig.3 Effects of ZNC on the genes related to cold regulation in pakchoi under cold stress

2.5 不同濃度ZNC對(duì)低溫脅迫下小白菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖4可知，低溫脅迫下小白菜可溶性蛋白和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量升高，噴施ZNC后積累量進(jìn)一步增加。與CK相比，Z0小白菜的可溶性蛋白含量和脯氨酸含量分別顯著增加35.94%、7.32%，Z1、Z2和Z3的可溶性蛋白含量較Z0增加49.55%、61.38%和63.80%，脯氨酸含量增加15.91%、6.25%和5.11%。說(shuō)明ZNC可通過(guò)增加小白菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累緩解其受到的低溫脅迫。

圖4 低溫脅迫下ZNC處理對(duì)小白菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.4 Effects of ZNC on the osmotic regulating substance content in pakchoi under cold stress

2.6 不同濃度ZNC對(duì)低溫脅迫下小白菜內(nèi)源激素的影響

由圖5可知，低溫和ZNC處理顯著影響小白菜葉片中內(nèi)源激素含量。與CK相比，Z0小白菜葉片中的IAA含量降低88.72%，ABA含量升高329.90%，GA含量降低91.04%。與Z0相比，Z1、Z2和Z3葉片中促進(jìn)小白菜生長(zhǎng)相關(guān)的激素含量顯著升高，其中IAA含量分別升高606.07%、453.57%、451.79%，GA含量分別顯著升高620.96%、750.27%、682.12%；抑制小白菜生長(zhǎng)的激素ABA含量顯著降低56.83%、73.62%、70.02%。因此，低溫脅迫下，噴施ZNC后小白菜葉片的(GA+IAA)/ABA比值顯著增加。說(shuō)明ZNC可通過(guò)調(diào)節(jié)小白菜內(nèi)源激素含量促進(jìn)小白菜低溫下生長(zhǎng)。

圖5 低溫脅迫下ZNC處理對(duì)小白菜內(nèi)源激素含量的影響Fig.5 Effects of ZNC on the endogenous hormone content in pakchoi under cold stress

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)噴施20 ng·mL-1的ZNC就能顯著降低低溫對(duì)小白菜造成的損傷，濃度僅為ABA的1/1 300[13]， 殼寡糖的1/62 500[14]，乙酰水楊酸的1/9 000[15]， 多胺的1/200 000[16]。極低的使用濃度意味著更低的成本，便于ZNC在實(shí)際農(nóng)業(yè)中推廣應(yīng)用。但本試驗(yàn)使用的ZNC濃度與王曉琪等[22]在水稻中應(yīng)用的濃度不同，推測(cè)可能是由于作物本身差異和處理時(shí)期及處理方法不同導(dǎo)致的，ABA在緩解小麥[13]和百慕大草[6]低溫脅迫時(shí)使用濃度也不同。

植物干物質(zhì)積累量的90%來(lái)自于光合作用[29]，低溫會(huì)造成植物光抑制，導(dǎo)致葉綠素含量降低，光合作用減弱，進(jìn)而抑制植物生長(zhǎng)[30]，降低產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理后的小白菜葉片SPAD值顯著降低26.02%，株高和地上部鮮重也顯著降低，說(shuō)明低溫導(dǎo)致小白菜光合色素降解，進(jìn)而影響其光合速率和生長(zhǎng)，這與岳俊芹等[31]在小麥中的研究結(jié)果相似。而噴施ZNC后小白菜SPAD值、株高和地上部鮮重較低溫處理總體顯著升高，說(shuō)明ZNC在低溫條件下能有效保持小白菜中光合色素含量，一定程度上維持正常光合作用供應(yīng)植物生長(zhǎng)，與王曉琪等[21]的研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，與CK相比，低溫處理后小白菜SOD活性升高，POD和CAT活性降低，推測(cè)可能由于長(zhǎng)期的低溫脅迫導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，抑制了酶的活性[32]，降低了H2O2的清除能力；且低溫處理4 d時(shí)H2O2含量處于較高水平，說(shuō)明小白菜正遭受氧化損傷[33]。噴施ZNC的小白菜葉片內(nèi)SOD、POD、CAT活性較低溫處理顯著升高，H2O2含量顯著降低，說(shuō)明ZNC可通過(guò)提高低溫脅迫下抗氧化酶的活性加速小白菜中多余H2O2的清除，緩解小白菜受到的氧化損傷。MDA含量通常被認(rèn)為是膜結(jié)構(gòu)完整性的指標(biāo)[34]。本研究中，低溫處理后MDA含量顯著增加，說(shuō)明此時(shí)植物細(xì)胞膜流動(dòng)性降低。噴施ZNC后MDA積累量顯著降低，說(shuō)明ZNC有效緩解了脂膜過(guò)氧化程度，維護(hù)了膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這與馬曉寒等[35]在低溫下對(duì)煙草使用茉莉酸甲酯降低煙草內(nèi)MDA含量的結(jié)果一致。

在前人對(duì)ZNC提高植物冷脅迫研究的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步揭示了ZNC可通過(guò)ICE-CBF-COR冷響應(yīng)通路提高小白菜耐寒能力的分子機(jī)理。ICE-CBF-COR冷響應(yīng)通路是提高植物抗寒性最重要的分子通路之一[8]。該通路中堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-hoop-helix，bHLH)家族誘導(dǎo)表達(dá)因子(inducer of CBF expression，ICE)能夠感受冷信號(hào)[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫下噴施ZNC對(duì)白菜內(nèi)BrICE1的表達(dá)量影響不顯著，說(shuō)明ZNC并未影響小白菜對(duì)冷信號(hào)的感應(yīng)。但低溫下噴施ZNC顯著提高了受BrICE1誘導(dǎo)的C-重復(fù)區(qū)結(jié)合因子(CRT-binding factors，CBF)BrCBF基因的相對(duì)表達(dá)。BrCBF表達(dá)后，將促進(jìn)冷調(diào)節(jié)基因(cold-regulated genes，COR)啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件被結(jié)合[37]，以此激活BrCOR14基因的大量表達(dá)[38]；而B(niǎo)rCOR14基因表達(dá)量的提高有利于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)生物合成關(guān)鍵酶含量的增加，進(jìn)而促進(jìn)可溶性蛋白和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累[39]，低溫下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累不僅能夠提高細(xì)胞滲透勢(shì)，防止細(xì)胞過(guò)度失水，還可以調(diào)節(jié)膜的運(yùn)輸能力，降低組織受到的低溫?fù)p傷，穩(wěn)定細(xì)胞器結(jié)構(gòu)[40]。本研究結(jié)果表明，低溫下噴施ZNC顯著增加了小白菜中可溶性蛋白和脯氨酸的積累，提高了其抗寒性，這與項(xiàng)洪濤等[41]利用ABA提高水稻抗寒性的研究結(jié)果類似。

植物激素是植物抵抗逆境脅迫，調(diào)控植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素[42]。前人研究表明，低溫脅迫下，植物可通過(guò)降低GA和IAA含量，提高ABA含量來(lái)提高抗寒性，但同時(shí)抑制了生長(zhǎng)[43]。本研究結(jié)果表明，低溫脅迫下，小白菜葉片中GA和IAA含量顯著降低，ABA含量顯著增加，顯著降低了(GA+IAA)/ABA比值，說(shuō)明低溫脅迫通過(guò)改變小白菜內(nèi)源激素含量抑制了小白菜生長(zhǎng)，這與許耀照等[44]的研究結(jié)果一致。葉噴20～40 ng·mL-1ZNC顯著增加了小白菜葉片中GA和IAA含量，降低了ABA含量，增加了(GA+IAA)/ABA比值，與前人使用亞精胺、精胺和5-氨基乙酰丙酸提高植物耐低溫性的效果類似[45-46]。說(shuō)明ZNC處理提高了小白菜抗低溫能力，使小白菜的激素代謝趨于正常，緩解了低溫對(duì)小白菜生長(zhǎng)的抑制作用。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，ZNC通過(guò)多路徑來(lái)提高小白菜的抗冷害能力，通過(guò)提高抗氧化酶活性和加速清除ROS來(lái)降低低溫對(duì)小白菜細(xì)胞膜造成的氧化損傷；通過(guò)增強(qiáng)低溫響應(yīng)通路ICE-CBF-COR響應(yīng)來(lái)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累以保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；最后通過(guò)提高(GA+IAA)/ABA比值來(lái)促進(jìn)小白菜生長(zhǎng)。綜上可知，葉噴20～40 ng·mL-1ZNC可有效緩解小白菜受到的低溫脅迫，促進(jìn)其在低溫下的生長(zhǎng)。