頭孢克肟膠囊微生物限度檢查法方法學(xué)驗(yàn)證

北京市豐臺(tái)區(qū)藥品檢驗(yàn)所（100071）呂崢崢

頭孢克肟適用于敏感菌所致的咽炎、扁桃體炎、急性支氣管炎和慢性支氣管炎急性發(fā)作、中耳炎、尿路感染、單純性淋病（宮頸炎或尿道炎）等。頭孢克肟為第三代口服頭孢菌素，通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成而起殺菌作用，對(duì)多數(shù)β內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，許多產(chǎn)青霉素酶和頭孢菌素酶菌株仍對(duì)本品敏感。本品對(duì)葡萄菌抗菌作用差，對(duì)銅綠假單胞菌、腸桿菌屬、脆弱擬桿菌、梭菌屬等無(wú)抗菌作用。

按照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄微生物限度檢查法中常規(guī)法進(jìn)行預(yù)檢驗(yàn)[1]，5種驗(yàn)證菌的回收率均小于70%。采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL/皿），白色念珠菌、黑曲霉回收率大于70%。由于本品為抗生素，對(duì)細(xì)菌具有很強(qiáng)的抑菌作用，試用離心沉淀法與薄膜過(guò)濾法聯(lián)用，同時(shí)將稀釋液改為含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，離心沉淀后取1∶100的供試液1mL采用薄膜過(guò)濾法，細(xì)菌類驗(yàn)證菌的回收率仍小于70%。因本品為脂溶性抗生素，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液配制供試品儲(chǔ)備液，離心沉淀后加入十四烷酸異丙酯，充分振搖，以500r/min離心3min，使水油完全分離，棄去油層，將水層混勻，作為1∶10的供試液，最終以1∶100的稀釋液為最低稀釋級(jí)，采用薄膜過(guò)濾法，以含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為沖洗液。當(dāng)沖洗量為500mL時(shí)，細(xì)菌類驗(yàn)證菌的回收率均大于70%。用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法（培養(yǎng)基的量為500mL）對(duì)本品進(jìn)行大腸埃希菌檢查，陽(yáng)性菌未生長(zhǎng)，說(shuō)明本品在該條件下對(duì)大腸埃希菌有抑菌作用，采用細(xì)菌計(jì)數(shù)項(xiàng)下供試液，取供試液5mL薄膜過(guò)濾，陽(yáng)性對(duì)照菌生長(zhǎng)正常。經(jīng)驗(yàn)證，此法適用于本品的微生物限度檢查，效果良好。

1 實(shí)驗(yàn)用品

1.1 供試品 頭孢克肟膠囊（批號(hào)：091001；規(guī)格：0.25g）。

1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）。均按照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄要求配制。

1.3 稀釋液 pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液；十四烷酸異丙酯。

1.4 沖洗液 含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（注：含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的配制方法：按照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄要求配制pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將3g的蛋黃卵磷脂用30g的聚山梨酯80溶解后，加入上述緩沖液1000mL中，混勻、分裝、滅菌。）。

1.5 菌種 枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]；金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]；大腸埃希菌[CMCC（B）44102]；白色念珠菌[CMCC（F）98001]；黑曲霉[CMCC（F）98003]。均符合《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄要求。

2 微生物限度檢查法草案

取本品10g，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試品儲(chǔ)備液，取供試品儲(chǔ)備液50mL，以500r/min離心3min，取上清液，加入十四烷酸異丙酯30mL，充分振搖，再以500r/min離心3min，棄去油層，取水層振搖混勻，制成1∶10的供試液，取1∶10的供試液 1mL加入含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9mL中，制成1∶100的供試液。細(xì)菌計(jì)數(shù)，取1∶100的供試液1mL，置含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，用薄膜過(guò)濾法處理，以含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液，每次100mL，共沖洗5次，取濾膜，依法檢查（中國(guó)藥典2010年版二部附錄ⅩⅠJ）。霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)，取1∶10的供試品儲(chǔ)備液1mL，注入5個(gè)平皿中，每皿0.2mL，依法檢查（《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅩⅠJ）。大腸埃希菌檢查，取1∶10的供試液5mL，置含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，用薄膜過(guò)濾法處理，沖洗方式同細(xì)菌計(jì)數(shù)項(xiàng)下，取濾膜，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100mL中，共制備2份，依法檢查（《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅩⅠJ）。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

按照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄中要求對(duì)上述擬定方法草案進(jìn)行驗(yàn)證。

3.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證[2][3]

3.1.1 菌液制備 ①接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，33℃培養(yǎng)24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10mL改良馬丁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24h。上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)為50cfu～100cfu的菌懸液。②接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7天，加入3mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。過(guò)濾菌絲吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)50cfu～100cfu的孢子懸液。

3.1.2 培養(yǎng)基適用性檢查 取上述制備好的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液各1mL（50cfu～100cfu），分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置33℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)；取上述制備好的白色念珠菌、黑曲霉菌液各1mL（50cfu～100cfu），分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置25℃培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)；同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%，且菌落形態(tài)大小與對(duì)照培養(yǎng)基的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定，見附表1。

3.1.3 供試液的制備 取本品10g，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試品儲(chǔ)備液，取供試品儲(chǔ)備液50mL，以500r/min離心3min，取上清液，加入十四烷酸異丙酯30mL，充分振搖，再以500r/min離心3min，棄去油層，取水層振搖混勻，制成1∶10的供試液，取1∶10的供試液 1mL加入含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9mL中，制成1∶100的供試液。

3.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

3.1.4.1 菌液組 分別取菌液1mL，采用平皿計(jì)數(shù)法，測(cè)定上述制備好的菌液中每毫升的活菌數(shù)，測(cè)定結(jié)果見附表2。

3.1.4.2 供試品對(duì)照組 取1∶100的供試液1mL，置含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，采用薄膜過(guò)濾法，沖洗液為含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，每次100mL，沖洗5次，測(cè)定供試品本底的細(xì)菌數(shù)，見附表3。取1∶10的供試品儲(chǔ)備液1mL，注入5個(gè)平皿中，每皿0.2mL，測(cè)定供試品本底的霉菌和酵母菌數(shù)，結(jié)果見附表3。

3.1.4.3 試驗(yàn)組 取1∶100的供試液1mL，按供試品對(duì)照組同法操作，在第5次沖洗液中加入上述細(xì)菌菌液1mL（50cfu～100cfu試驗(yàn)菌），進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，測(cè)定結(jié)果見附表4。計(jì)算回收率見附表5。取1∶10的供試品儲(chǔ)備液0.2mL和上述真菌菌液1mL（50cfu～100cfu試驗(yàn)菌），分別注入同一平皿中，進(jìn)行霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)，測(cè)定結(jié)果見附表4，計(jì)算回收率見附表5。

3.1.4.4 稀釋劑對(duì)照組 取上述細(xì)菌菌液50mL（2500cfu～5000cfu試驗(yàn)菌），500r/min離心3min，取上清液，加入十四烷酸異丙酯30mL，充分振搖，再以500r/min離心3min，棄去油層，取水層振搖混勻，即為稀釋劑對(duì)照液，取1mL，置含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，采用薄膜過(guò)濾法，沖洗液為含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，每次100mL，沖洗5次，測(cè)定細(xì)菌菌數(shù)，測(cè)定結(jié)果見附表6，計(jì)算回收率見附表7。霉菌和酵母菌數(shù)未采用特殊的方法處理，故稀釋劑對(duì)照組可不進(jìn)行驗(yàn)證。

將上述用于細(xì)菌計(jì)數(shù)的濾膜，貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，置33℃培養(yǎng)3天，逐日觀察結(jié)果，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置25℃培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果。

經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用擬定草案中的方法，可消除本品對(duì)細(xì)菌的抑菌作用，使細(xì)菌類驗(yàn)證菌的回收率能夠達(dá)到要求；采用培養(yǎng)基稀釋法即可使真菌類驗(yàn)證菌的回收率達(dá)到要求，方法可行。

3.2 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

3.2.1 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至 10mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中， 33℃培養(yǎng)24h。用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9mL制成每1mL含菌數(shù)為10cfu～100cfu菌懸液。

3.2.2 控制菌（大腸埃希菌）檢查用培養(yǎng)基適用性檢查

3.2.2.1 膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力和抑制能力檢查 接種不大于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在33℃培養(yǎng)24h，結(jié)果顯示，與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌生長(zhǎng)良好，符合規(guī)定。接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌于膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，在33℃培養(yǎng)24h，結(jié)果顯示，未有菌生長(zhǎng)，符合規(guī)定。

3.2.2.2 4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）促生長(zhǎng)能力和指示能力檢查 接種不大于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在33℃培養(yǎng)5h，結(jié)果顯示，與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌生長(zhǎng)良好，符合規(guī)定。與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管熒光及指示劑反應(yīng)一致，符合規(guī)定。

3.2.3 供試液的制備 取本品10g，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試品儲(chǔ)備液，取供試品儲(chǔ)備液50mL，以500r/min離心3min，取上清液，加入十四烷酸異丙酯30mL，充分振搖，再以500r/min離心3min，棄去油層，取水層振搖混勻，制成1∶10的供試液。

附表1 培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果

附表2 菌液組菌落計(jì)數(shù)（cfu）

附表3 供試品組菌落計(jì)數(shù)（cfu/皿）

附表4 試驗(yàn)組菌落計(jì)數(shù)（cfu/皿）

附表5 試驗(yàn)組回收率測(cè)定結(jié)果

附表6 稀釋劑對(duì)照組菌落計(jì)數(shù)（cfu）

附表7 稀釋劑組回收率測(cè)定結(jié)果表

3.2.4 大腸埃希菌檢查方法的驗(yàn)證

3.2.4.1 供試品組 取供試液5mL加至含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，用薄膜過(guò)濾器過(guò)濾，以含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液，每次100mL，共沖洗5次，取濾膜，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100mL中，置 33℃培養(yǎng)24h，共制備2份。

3.2.4.2 陰性對(duì)照組 取稀釋液10mL，加至含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，用薄膜過(guò)濾器過(guò)濾，以含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液，每次100mL，共沖洗5次，取濾膜，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100mL中，置 33℃培養(yǎng)24h。

3.2.4.3 陽(yáng)性對(duì)照組 取供試液5mL，加至含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，用薄膜過(guò)濾器過(guò)濾，以含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液，每次100mL，共沖洗5次，取濾膜，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100mL中，加入上述大腸埃希菌菌液1mL（10cfu～100cfu），置33℃培養(yǎng)24h。

取上述培養(yǎng)物各0.2mL，分別加入含5mL的4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）試管中，置33℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，見附表8。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照菌生長(zhǎng)良好，表明本品在該條件下對(duì)大腸埃希菌無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)。說(shuō)明采用該法進(jìn)行本品的大腸埃希菌檢查可行。

總之，前述擬定的方法草案可行。

4 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)論

微生物限度：取本品10g，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試品儲(chǔ)備液，取供試品儲(chǔ)備液50mL，以500r/min離心3min，取上清液，加入十四烷酸異丙酯30mL，充分振搖，再以500r/min離心3min，棄去油層，取水層振搖混勻，制成1∶10的供試液，取1∶10的供試液 1mL加入含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9mL中，制成1∶100的供試液。細(xì)菌計(jì)數(shù)，取1∶100的供試液1mL，置含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，用薄膜過(guò)濾法處理，以含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液，每次100mL，共沖洗5次，取濾膜，依法檢查（《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅩⅠJ）。霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)，取1∶10的供試品儲(chǔ)備液1mL，注入5個(gè)平皿中，每皿0.2mL，依法檢查（《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅩⅠJ）。大腸埃希菌檢查，取1∶10的供試液5mL，置含3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，用薄膜過(guò)濾法處理，沖洗方式同細(xì)菌計(jì)數(shù)項(xiàng)下，取濾膜，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100mL中，共制備2份，依法檢查（《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅩⅠJ）。但1g供試品中，細(xì)菌數(shù)不得過(guò)1000cfu，霉菌和酵母菌數(shù)不得過(guò)100cfu，大腸埃希菌不得檢出。

附表8 大腸埃希菌檢查結(jié)果

附表9 供試品微生物限度檢查結(jié)果

5 供試品的檢查

按照上述確定的微生物限度檢查方法檢驗(yàn)供試品，結(jié)果符合規(guī)定，見附表9。

6 討論

頭孢克肟是具有較強(qiáng)抑菌活性的藥物，在微生物限度檢驗(yàn)中應(yīng)采用適當(dāng)方法消除其抑菌作用。本法采用3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液，離心沉淀后，加入十四烷酸異丙酯，充分振搖，以500r/min離心3min，使水油完全分離，棄去油層，將水層混勻，作為1∶10的供試液，最終以1∶100的稀釋液為最低稀釋級(jí)，分別運(yùn)用培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過(guò)濾法制得供試品溶液，經(jīng)驗(yàn)證，驗(yàn)證菌株均生長(zhǎng)良好，適用本品的微生物限度檢查。