清音丸改劑型前后對免疫低下模型小鼠作用的比較研究

北京市藥品檢驗(yàn)所（100035）李雪梅 周建平 胡宇馳

清音丸主要由訶子肉、川貝母、百藥煎、烏梅肉、葛根、茯苓、甘草、天花粉以上入味，粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻。每100g粉末用煉蜜40～50g加適量的水泛丸，干燥，制成水蜜丸；或加煉蜜110～130g制成大蜜丸，即得。具有清熱利咽，生津潤燥的功效，主要用于治療肺熱津虧導(dǎo)致的咽喉不利、口舌干燥、聲啞失音。清音片是在清音丸原劑型—水蜜丸、大蜜丸的基礎(chǔ)上改變劑型而成，產(chǎn)品提取率為2.5g生藥/g清音片藥粉，制成片劑。清音片擬定具有與原劑型清音丸相同的功能主治，其臨床使用量與清音片相同（折合生藥量）。我中心深入研究了清音丸、片對免疫系統(tǒng)功能的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料

1.1 藥品 本試驗(yàn)用清音片藥粉（批號：100217，產(chǎn)品提取率為2.5g生藥提取1g清音片）、清音丸蜜丸藥粉（批號：100215）均由北京同仁堂股份有限公司科學(xué)研究所提供；參芪顆粒（批號：20100302)，江西山高制藥有限公司；清喉利咽顆粒（批號：100902），天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂仁堂制藥廠；布洛芬片（批號：20100106），北京太平洋藥業(yè)有限公司。

1.2 動物 SD大鼠，ICR小鼠，均為SPF級，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0006號。

1.3 試劑 伊文思蘭（批號：871225），中國醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站；丙酮（批號：20100615），北京化工廠；注射用環(huán)磷酰胺（批號：10070821），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.4 儀器 TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

2 方法[1][2]

2.1 對免疫功能低下小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響（小鼠碳粒廓清法） ICR小鼠，雌雄各半，體重18～20g，按體重隨機(jī)分成9組，每組10只，分別為空白對照組、模型對照組、清音丸、清音片大、中、小劑量組（按生藥量計(jì)，0.910g/kg，0.455g/kg，0.228g/kg），參芪顆粒陽性對照組（1g/kg），每天Ig給藥，連續(xù)給藥14d。除空白對照組外，其余各組分別于給藥后第8d、10d給予每只小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg，造成小鼠免疫功能低下模型，于末次給藥后1h，給予每只小鼠尾靜脈注射印度墨汁10mL/kg，注射后1min、5min分別從小鼠眼靜脈叢取血20μL，溶于0.1%Na2CO3溶液中搖勻，在680nm處測定吸光度（A），最后將小鼠頸椎脫臼處死，分別稱取肝脾重量。按下列公式計(jì)算廓清指數(shù)（K）和校正廓清指數(shù)（a），×體重/（肝重+脾重）。

2.2 對二硝基氯苯致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響試驗(yàn) ICR小鼠96只，雌雄各半，體重18～20g，按體重隨機(jī)分成8組，每組12只，分別為空白對照組，清音丸、清音片大、中、小劑量組（按生藥量計(jì)，0.910g/kg，0.455g/kg，0.228g/kg），參芪顆粒陽性對照組（1g/kg）。試驗(yàn)前一天用刀片對小鼠腹部進(jìn)行脫毛，第二天將50%DNCB丙酮溶液2μL/只涂于小鼠腹部脫毛區(qū)進(jìn)行致敏，致敏后按20mL/kg開始給藥，對照組給予同體積去離子水。連續(xù)給藥12d后，于小鼠腹部脫毛區(qū)涂2.5%DNCB丙酮溶液20μL/只進(jìn)行攻擊。24h后，每鼠尾靜脈注射1%伊文思蘭10mL/kg。30min后處死小鼠，取下腹部藍(lán)染皮膚，剪碎，置試管中，用1∶1丙酮生理鹽水混合液4mL浸泡24h后，離心取上清液，于610nm處測定吸光度（A），各組進(jìn)行比較。

2.3 對免疫功能低下小鼠血清溶血素形成的影響（溶血素法） ICR小鼠108只，雌雄各半，體重18～20g，按體重隨機(jī)分成9組，每組12只，分別為空白對照組，模型對照組，清音丸、清音片大、中、小劑量組（按生藥量計(jì)，0.910g/kg，0.455g/kg，0.228g/kg），參芪顆粒陽性對照組（1g/kg），按20mL/kg每天Ig給藥，連續(xù)給藥14d。給藥后第7d，各組動物按0.2mL/只腹腔注射5%雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液進(jìn)行免疫。除空白對照組外，其余各組分別于給藥后第8d、10d，給每只小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg，造成小鼠免疫功能低下模型。并于免疫后第6d，各組動物取血，將血清稀釋1倍（稀釋血清）。取稀釋血清0.25mL，與5%雞紅細(xì)胞0.125mL、10%豚鼠血清（補(bǔ)體）0.125mL作用后，在37℃恒溫箱中保溫30min后，0℃冰箱終止反應(yīng)后離心，取上清液于540nm處測定吸光度（A），各組進(jìn)行比較。

3 結(jié)果

3.1 清音片對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響（小鼠碳粒廓清法） 對腹腔注射環(huán)磷酰胺造成免疫低下模型小鼠Ig清音片，在0.910g生藥/kg劑量下，碳粒廓清指數(shù)與模型對照組比較有顯著性意義，提示清音片能增強(qiáng)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，即能增強(qiáng)小鼠免疫功能[3]。而清音丸對小鼠廓清指數(shù)則未見明顯影響，結(jié)果見附表1。

3.2 清音片對二硝基氯苯致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果表明：小鼠口服清音丸、清音片，對DNCB致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)無明顯影響作用。但從吸光度值上看，清音丸、清音片吸光度值較空白對照組較高，且清音丸組吸光度值較清音片組較高，由此推斷如給藥劑量增加，可能會增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用[3][4]，結(jié)果見附表2。

3.3 清音片對免疫低下小鼠血清溶血素形成的影響（溶血素法） 試驗(yàn)結(jié)果表明：給藥14d后，在0.910g生藥/kg劑量下，清音片能明顯增加免疫低下模型小鼠血清抗原抗體反應(yīng)量，其血清反應(yīng)的吸光度值與模型對照組比較差異有顯著性意義。由此可見，對腹腔注射環(huán)磷酰胺造成免疫低下模型小鼠，清音片對雞紅細(xì)胞所致小鼠特異性抗體生成有明顯促進(jìn)作用，反映清音片具有一定增強(qiáng)體液免疫的作用[3]，結(jié)果見附表3。

4 討論

清音片是在清音丸的基礎(chǔ)上改變劑型而成。本方中訶子肉斂肺，澀腸，下氣。川貝母潤肺散結(jié)，止咳化痰。百藥煎潤肺化痰，生津止渴。烏梅肉收斂生津，安蛔驅(qū)蟲。葛根解表退熱，生津透疹，升陽止瀉。茯苓利水滲濕，健脾寧心。甘草補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和藥性。天花粉清熱生津，消腫排膿。多藥并用，共奏清熱利咽、生津潤燥之效。現(xiàn)代臨床主要用于治療慢性咽炎[3]。

機(jī)體免疫系統(tǒng)是由非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫共同構(gòu)成。機(jī)體免疫功能低下可致感染、腫瘤等多種疾病。文獻(xiàn)報(bào)道，清音丸在2g/kg劑量時(shí)具有增強(qiáng)小鼠非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能對治療慢性咽炎具有一定作用[3]。

附表1 清音片對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響（ ±s，n=10）

附表1 清音片對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響（ ±s，n=10）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型對照組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

組別 給藥劑量（g/kg） 廓清指數(shù)（k） 校正廓清指數(shù)（a）空白對照 - 0.09±0.022) 6.36±0.88模型 - 0.05±0.02 5.94±1.39清音片0.910 0.09±0.022) 6.82±0.71 0.455 0.06±0.01 6.31±0.90 0.228 0.06±0.01 6.36±0.70 0.910 0.06±0.01 7.02±0.96 0.455 0.06±0.04 6.01±1.62 0.228 0.08±0.02 7.07±0.71參芪顆粒 1 0.09±0.032) 7.44±1.083)清音丸

附表2 清音片對DNCB致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響試驗(yàn)（ ±s，n=12）

附表2 清音片對DNCB致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響試驗(yàn)（ ±s，n=12）

注：與空白對照組比較， 1）P＜0.05；與模型對照組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

組別 給藥劑量（g/kg） 吸光度值（Abs）空白對照 - 0.44±0.18清音片0.910 0.53±0.22 0.455 0.45±0.13 0.228 0.45±0.14 0.910 0.58±0.13 0.455 0.52±0.13 0.228 0.47±0.22參芪顆粒 1 0.66±0.191)清音丸

附表3 清音丸、清音片對小鼠血清溶血素形成的影響（ ±s，n=12）

附表3 清音丸、清音片對小鼠血清溶血素形成的影響（ ±s，n=12）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型對照組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

組別 給藥劑量（g/kg） 吸光度值（Abs）空白對照 - 0.60±0.103)模型對照 - 0.36±0.08清音片0.910 0.51±0.102)0.455 0.41±0.11 0.228 0.30±0.11 0.910 0.49±0.122)0.455 0.38±0.17 0.228 0.36±0.11參芪顆粒 1 0.58±0.143)清音丸

本文主要從對免疫系統(tǒng)功能作用影響方面比較了清音片和清音丸的主要藥效作用。對腹腔注射環(huán)磷酰胺造成免疫低下的小鼠，在非特異性免疫功能試驗(yàn)中，吞噬指數(shù)K反映網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，吞噬活性a則反映單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

試驗(yàn)結(jié)果表明，清音片非特異性免疫功能作用效果優(yōu)于清音丸；在二硝基氯苯致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)中，二硝基氯苯是小分子半抗原，將其涂于皮膚上，可透過上皮與角質(zhì)蛋白及膠原蛋白結(jié)合成全抗原，并刺激T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為致敏淋巴細(xì)胞，分布于全身皮膚內(nèi)。以二硝基氯苯攻擊，即可見攻擊部位形成遲發(fā)型皮膚過敏反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，清音片、清音丸沒有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用。血清溶血素的測定主要反映抗體形成的數(shù)量，也提示合成抗體的能力，是反映體液免疫的重要指標(biāo)。在血清溶血素試驗(yàn)中，清音丸和清音片以0.910g/kg劑量下都有增強(qiáng)免疫的作用。

綜上所述，清音丸由蜜丸改成片劑后，在本試驗(yàn)劑量和試驗(yàn)條件下具有增強(qiáng)體液免疫和非特異性免疫功能的作用。