高遷移率族蛋白B1單抗對急性壞死性胰腺炎小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

夏敏 張婷 郭繼中 陳衛(wèi)昌

·短篇論著·

高遷移率族蛋白B1單抗對急性壞死性胰腺炎小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

夏敏 張婷 郭繼中 陳衛(wèi)昌

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box chromosomal protein 1, HMGB1)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的非組核蛋白，它通過結(jié)合晚期糖基化終端產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycated end-products，RAGE)及Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)家族成員TLR2和TLR4進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)NF-κB核移位，觸發(fā)炎癥反應(yīng)[1]。HMGB1作為晚期炎癥因子參與了急性胰腺炎的全身炎癥反應(yīng)[2]。本研究應(yīng)用HMGB1單抗干預(yù)急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)小鼠，探討其保護(hù)機(jī)制。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動物及分組：雄性ICR(Institute for Cancer Research)小鼠108只，體重20～25 g，由江蘇省血吸蟲病防治研究所動物房提供。按隨機(jī)表法分為正常對照組、ANP組和HMGB1單抗處理組(HMGB1)。參照文獻(xiàn)[3]，采用腹腔注射20%L-精氨酸(200 mg/100 g體重)2次、間隔1 h的方法制備ANP模型。HMGB1組于制模24 h后腹腔內(nèi)注射HMGB1單抗200 μg[4]，正常對照組及ANP組大鼠腹腔注射等容積無菌生理鹽水。注射后12、24、48 h分批處死大鼠，取血和新鮮胰腺組織。

2．血清HMGB1濃度測定：采用ELISA法。試劑盒購自日本SHINO-TEST公司，嚴(yán)格按說明書操作。

3．胰腺組織HMGB1 mRNA表達(dá)檢測：應(yīng)用Trizol提取小鼠胰腺組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時熒光定量PCR法檢測HMGB1 mRNA的表達(dá)，以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。HMGB1引物序列上游5′-ACAGCCATTGCAGTACATTGAG-3′，下游5′-TTGCCCATGTTTAGTTGATTTTCC-3′，熒光探針序列：5′-(FAM)AGAGTCGCCCAGTGCCCGTCCG (Eclipse)-3′，擴(kuò)增片段113 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、58℃ 30 s，40個循環(huán)，最后72℃延伸1 min。采用LightCycler熒光定量PCR儀，通過儀器自帶軟件記錄循環(huán)周期數(shù)(crossing point，CP)，計算△CP值，表示mRNA表達(dá)量。

4．細(xì)胞凋亡及壞死測定：將新鮮胰腺組織制成勻漿，應(yīng)用Annexin V/PI雙染色法在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡及壞死。

5．胰腺組織NF-κB蛋白表達(dá)檢測：采用常規(guī)免疫組化法檢測NF-κB的表達(dá)。應(yīng)用Tiger 920圖像分析軟件掃描計算陽性面積的積分光吸收值和平均光吸收值作為蛋白的表達(dá)量。

二、結(jié)果

1．小鼠血清HMGB1濃度的變化：ANP組小鼠血清HMGB1濃度顯著高于正常對照組，HMGB1組顯著低于ANP組(表1)。

表1 3組小鼠血清 HMGB1濃度的變化

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

2．小鼠胰腺組織HMGB1 mRNA表達(dá)的變化： ANP組小鼠胰腺組織HMGB1 mRNA表達(dá)顯著高于正常對照組，HMGB1組的表達(dá)顯著低于ANP組，但仍顯著高于正常對照組(表2)。

表2 3組小鼠胰腺組織 HMGB1 mRNA 表達(dá)

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

3．小鼠胰腺細(xì)胞凋亡和壞死率的變化：ANP組小鼠胰腺細(xì)胞壞死率顯著高于正常對照組，而凋亡率顯著低于正常對照組；HMGB1組小鼠胰腺細(xì)胞壞死率較ANP組顯著減少，而凋亡率顯著增加(表3，圖1)。

表3 3組小鼠胰腺細(xì)胞的凋亡率及壞死率比較

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

圖1對照組(a)、ANP組(b)、HMGB1組(c)胰腺細(xì)胞的凋亡(上，24 h)和壞死(下，48 h)

4．小鼠胰腺組織NF-κB表達(dá)的變化：對照組、ANP、HMGB1組小鼠胰腺組織在48 h時的NF-κB表達(dá)量分別為88.93±2.07、295.16±20.76、81.11±9.02(圖2)。ANP組顯著高于對照組(P<0.05)；HMGB1組顯著低于ANP組(P<0.05)，而與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。運(yùn)用線性回歸統(tǒng)計學(xué)分析，ANP組小鼠48 h時的血清HMGB1濃度與胰腺NF-κB表達(dá)水平呈線性正相關(guān)(r=0.883，P<0.05，圖3)。

圖2對照組(a)、ANP組(b)、HMGB1組(c)胰腺組織NF-κB表達(dá)(免疫組化 ×400)

圖3 建模后48 h血清HMGB1濃度與NF-κB表達(dá)的相關(guān)性

討論重癥急性胰腺炎時炎性細(xì)胞因子的大量釋放可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，并進(jìn)一步惡化發(fā)展為多器官功能障礙綜合征(MODS)、多器官功能衰竭(MOF)。早期釋放的炎癥因子如TNF-α和IL-1β等均在發(fā)病后迅速升高至峰值，隨即迅速下降，但炎癥反應(yīng)和臟器損害仍在繼續(xù)，提示可能有某些晚期炎癥因子參與了病理過程。近年來大量研究結(jié)果表明，HMGB1可能作為重要的晚期炎癥遞質(zhì)參與急性胰腺炎的全身炎癥反應(yīng)。本研究采用腹腔內(nèi)注射L-精氨酸制作小鼠ANP模型，結(jié)果顯示血清HMGB1水平在建模后12 h開始明顯升高，24 h至高峰，48 h仍維持在較高水平；胰腺組織HMGB1 mRNA表達(dá)水平在建模后12 h開始升高，24 h顯著升高。ANP時小鼠血清HMGB1濃度的升高可能有兩方面的機(jī)制，首先ANP時炎性因子過度激活，激活的巨嗜細(xì)胞/單核細(xì)胞主動分泌HMGB1，其次與ANP時受損的器官產(chǎn)生和釋放HMGB1有關(guān)。給予HMGB1單抗干預(yù)后胰腺組織HMGB1 mRNA表達(dá)水平明顯下降，血清HMGB1濃度也明顯下降。

細(xì)胞凋亡已被證實(shí)在許多生物過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，包括炎癥反應(yīng)。內(nèi)毒素、燒傷、缺血等均可導(dǎo)致相關(guān)臟器的細(xì)胞凋亡。1995年Kaise等[5]報道，ANP大鼠胰腺見大量壞死細(xì)胞，凋亡細(xì)胞少見；而急性水腫型胰腺炎(AEP)大鼠胰腺見大量凋亡細(xì)胞，壞死細(xì)胞少見。作者認(rèn)為凋亡細(xì)胞對腺泡細(xì)胞的保護(hù)作用阻止了AEP向ANP的發(fā)展。Saluja等[6]的動物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了相似的結(jié)論，預(yù)先誘發(fā)細(xì)胞凋亡能防止胰腺腺泡的損傷，減少ANP的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANP小鼠胰腺腺泡細(xì)胞壞死率較對照組顯著增高，凋亡率明顯降低，HMGB1單抗抑制HMGB1表達(dá)后胰腺壞死率顯著降低，凋亡率增高，表明HMGB1的表達(dá)與凋亡逃逸有關(guān)。凋亡細(xì)胞不釋放HMGB1，不會觸發(fā)炎癥反應(yīng)；相反，壞死細(xì)胞HMGB1松散地結(jié)合在分裂間期和分裂期的細(xì)胞核上，當(dāng)細(xì)胞壞死、細(xì)胞膜通透性升高、細(xì)胞膜的完整性破壞后，HMGB1很快就泄漏至細(xì)胞外。HMGB1作為一種內(nèi)源性危險信號提醒機(jī)體免疫系統(tǒng)警覺壞死細(xì)胞的存在，適度的細(xì)胞凋亡對ANP時胰腺腺胞細(xì)胞可能具有保護(hù)作用。

HMGB1通過與細(xì)胞表面不同受體例如晚期糖基化終端產(chǎn)物受體RAGE、Toll樣受體家族TLR2和TLR4相結(jié)合啟動炎癥反應(yīng)[7]，與這些受體結(jié)合后可導(dǎo)致NF-κB信號途徑激活，促進(jìn)炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、INF-γ的產(chǎn)生[8]。有作者認(rèn)為，NF-κB的激活對AP的發(fā)生、發(fā)展和持續(xù)惡化起了非常關(guān)鍵的作用[9]。本研究結(jié)果顯示，NF-κB的表達(dá)與ANP小鼠HMGB1血清濃度呈正相關(guān)；HMGB1單抗抑制血清HMGB1水平的同時可降低NF-κB的濃度，提示HMGB1可能通過激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。因此通過各種途徑下調(diào)血清HMGB1水平或拮抗其作用，阻斷炎癥瀑布反應(yīng)是臨床防治重癥急性胰腺炎的關(guān)鍵。

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2012-08-09)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.019

214023 無錫，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院消化科(夏敏、郭繼中)；江蘇省中醫(yī)院消化科(張婷)；蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科(陳衛(wèi)昌)

夏敏，Email:xmzb11013@163.com