胰腺癌組織Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1蛋白的表達(dá)及其臨床意義

馬丹 滿曉華 高軍 李兆申

·論著·

胰腺癌組織Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1蛋白的表達(dá)及其臨床意義

馬丹 滿曉華 高軍 李兆申

目的探討Hedgehog信號(hào)通路重要成員Shh、Gli1、Sufu以及TAK1和磷酸化TAK1(p-TAK1)在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。方法應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)38例手術(shù)切除的胰腺癌組織及其配對(duì)的癌旁胰腺組織中Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1蛋白的表達(dá)，分析它們與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系及它們相互間的關(guān)系。結(jié)果胰腺癌組織Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1蛋白的表達(dá)率分別為86.8%(33/38)、52.6%(20/38)、68.4%(26/38)、55.3%(21/38)、52.6%(20/38),而癌旁胰腺組織中的表達(dá)均為陰性。Gli1表達(dá)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)(r值分別為0.524、0.361，P值均<0.05)；Sufu表達(dá)與患者性別相關(guān)(r=-0.378，P<0.05)；TAK1表達(dá)與胰腺癌臨床分期呈正相關(guān)(r=0.468，P<0.05)；p-TAK1表達(dá)與臨床分期、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(r值分別為0.418、0.361，P值均<0.05)。胰腺癌組織中Gli1的表達(dá)水平與TAK1及p-TAK1呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論Hedgehog信號(hào)通路及TAK1途徑在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用，且兩條途徑可能存在一定的相互作用。

胰腺腫瘤； 免疫組織化學(xué)； Hedgehog信號(hào)通路； 絲裂原激活蛋白激酶激酶類

Hedgehog信號(hào)通路與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。絲裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶激酶(MAPKKK)家族成員之一TGF-β激活激酶-1(TAK1)是炎癥免疫、應(yīng)激反應(yīng)及腫瘤發(fā)生等過(guò)程中許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)連鎖反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子。近年文獻(xiàn)報(bào)道，TAK1誘導(dǎo)的NF-κB激活與胰腺癌中Hedgehog通路的活化有關(guān)[2-3]。因此，本研究檢測(cè)Hedgehog通路重要成員Shh、Gli1、Sufu以及TAK1和其活化形式磷酸化TAK1(p-TAK1)在胰腺導(dǎo)管腺癌及相應(yīng)癌旁胰腺組織中的表達(dá)，分析Hedgehog信號(hào)通路與TAK1途徑之間的關(guān)系及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，探討它們?cè)谝认侔┌l(fā)生中的作用。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

收集2010年9月1日至2012年9月11日第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院胰腺外科手術(shù)切除的38例胰腺癌組織和配對(duì)的癌旁組織，同時(shí)收集相應(yīng)病例的臨床資料。所有患者術(shù)前均未行化療和放療。術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌。38例患者中男性23例，女性15例，年齡35～82歲，平均(60±11)歲。

二、Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1蛋白檢測(cè)

手術(shù)切除標(biāo)本常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片(厚度為4 μm)，采用免疫組化EnVision染色法(二步法)檢測(cè)Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1蛋白的表達(dá)。兔抗人Shh單抗、Gli1多抗、Sufu單抗、TAK1多抗、p-TAK1多抗均購(gòu)自Abcam公司。Shh定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，Gli1、Sufu、TAK1及p-TAK1定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性染色。結(jié)果判斷根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比以及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，>5%～≤25%為1分，>25%～≤50%為2分，>50%為3分；無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩分值相乘得到最終分值，0分為-，1～2分為+，3～4分為++，6～9分為+++。++或+++定義為表達(dá)陽(yáng)性， -或+定義為表達(dá)陰性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法分析胰腺癌組織中Shh、Gli1、Sufu、TAK1及p-TAK1表達(dá)水平之間的相關(guān)性及它們與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胰腺癌組織Shh、Gli1、Sufu的表達(dá)

Shh陽(yáng)性表達(dá)于胰腺導(dǎo)管腺癌癌細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)(圖1)，陽(yáng)性表達(dá)率為86.8%(33/38)，其中++ 26例，+++ 7例。Gli1、Sufu陽(yáng)性表達(dá)于胰腺導(dǎo)管腺癌癌細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)(圖1)。Gli1陽(yáng)性表達(dá)率為52.6%(20/38)，其中++ 15例，+++ 5例。Sufu陽(yáng)性表達(dá)率為68.4%(26/38)，其中++ 12例，+++ 14例。癌旁胰腺組織的導(dǎo)管、腺泡和胰島中Shh、Gli1、Sufu的表達(dá)水平均陰性，胰腺癌組織此3種蛋白的表達(dá)均顯著高于癌旁胰腺組織(P值均<0.05)。

圖1胰腺癌組織(左)和癌旁組織(右)Shh(上)、Gli1(中)、Sufu(下)蛋白的表達(dá)(免疫組化 ×200)

二、胰腺癌組織TAK1及p-TAK1的表達(dá)

TAK1及p-TAK1陽(yáng)性表達(dá)于胰腺導(dǎo)管腺癌癌細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)，腫瘤細(xì)胞周圍炎性細(xì)胞亦有不同程度的表達(dá)(圖2)。TAK1陽(yáng)性表達(dá)率為55.3%(21/38)，其中++ 15例，+++ 6例。p-TAK1陽(yáng)性表達(dá)率為52.6%(20/38)，其中++ 18例，+++ 2例。癌旁胰腺組織導(dǎo)管、腺泡和胰島中TAK1和p-TAK1表達(dá)陰性，胰腺癌組織TAK1及p-TAK1的表達(dá)均顯著高于癌旁胰腺組織(P值均<0.05)。

三、胰腺癌組織Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1表達(dá)與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

腫瘤臨床病理參數(shù)包括患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期等。Shh表達(dá)與所有的臨床病理參數(shù)均無(wú)關(guān)；Gli1表達(dá)僅與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)(r值分別為0.524，0.361，P值均<0.05)；Sufu表達(dá)只與患者性別相關(guān)(r=-0.378，P<0.05)；TAK1表達(dá)只與胰腺癌臨床分期呈正相關(guān)(r=0.468，P<0.05)；p-TAK1表達(dá)與臨床分期、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(r值分別為0.418、0.361，P<0.05，表1)。

圖2胰腺癌組織(左)和癌旁組織(右)TAK1(上)、p-TAK1(下)的表達(dá)(免疫組化 ×200)

表1 胰腺癌組織中Shh、Gli1、Sufu、TAK1及p-TAK1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

胰腺癌組織中Gli1的表達(dá)水平與TAK1及p-TAK1呈正相關(guān)(P<0.05)，而Shh、Sufu的表達(dá)水平與TAK1、p-TAK1無(wú)相關(guān)性。此外，Shh、Gli1、Sufu三者間的表達(dá)水平均無(wú)相關(guān)性。

討 論

Hedgehog(Hh)信號(hào)通路是胚胎發(fā)育的主要調(diào)控子,其產(chǎn)物控制細(xì)胞分化、增殖和組織成形。Hh信號(hào)通路由配體Hh、膜受體Ptch及Smo、Sufu、COS2、核轉(zhuǎn)錄因子Gli和下游靶基因組成。成人正常組織中Hh信號(hào)通路無(wú)活化或低活化，但在胰腺癌中Hh信號(hào)通路異常激活[1]。在小鼠的發(fā)育過(guò)程中，Shh的異常表達(dá)可引起類似于人胰腺癌的早期病變[4]。在胰腺癌早期及癌前病變階段即可檢測(cè)到Hh信號(hào)通路的激活。對(duì)不同時(shí)期的胰腺上皮內(nèi)瘤變及胰腺癌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著上皮內(nèi)瘤變向胰腺癌的逐步發(fā)展，病變組織中Hh信號(hào)通路成員的表達(dá)水平也急劇上升。Shh、Ptch和Glil蛋白在胰腺癌組織中呈低到中度表達(dá)[5]。Sufu蛋白在胰腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)，而在癌旁胰腺組織及正常胰腺組織中均未見(jiàn)表達(dá)[6]。本研究結(jié)果顯示,胰腺癌組織中Shh、Gli1、Sufu呈高表達(dá)，與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。通過(guò)與腫瘤臨床病理參數(shù)關(guān)系的分析，胰腺癌組織中Gli1的表達(dá)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)，更進(jìn)一步突出了Gli1在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

TAK1是炎癥免疫、應(yīng)激反應(yīng)及腫瘤發(fā)生等過(guò)程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)連鎖反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子。有文獻(xiàn)報(bào)道，TAK1通過(guò)活化NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)參與胰腺癌對(duì)化療藥物的耐受性，沉默或抑制TAK1基因表達(dá)是逆轉(zhuǎn)胰腺癌內(nèi)在耐藥性的有效方法[7]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中TAK1及其活化形式p-TAK1均高表達(dá)，而且TAK1的表達(dá)與胰腺癌臨床分期呈正相關(guān)，p-TAK1的表達(dá)與臨床分期及胰腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)，證實(shí)TAK1途徑亦在胰腺癌發(fā)生中起作用。TAK1通過(guò)多種形式廣泛參與NF-κB的活化。而NF-κB的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)之一便是Hh通路的配體Shh[8]。某些炎性因子(如IL-1β、TNF-α等)可通過(guò)激活NF-κB導(dǎo)致Shh的過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而激活Hh信號(hào)通路，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中TAK1及p-TAK1的表達(dá)水平與Gli1存在相關(guān)性，亦提示在胰腺癌發(fā)展過(guò)程中兩條途徑可能存在協(xié)同作用，但其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1] Jones S, Zhang X, Parsons DW,et al. Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by global genomic analyses. Science, 2008,321: 1801-1806.

[2] Nakashima H,Nakamura M,Yamaguehi H,et al.Nuclear factor-kappaB contributes to hedgehog signaling pathway activation through sonic hedgehog induction in pancreatic cancer. Cancer Res,2006,66:7041-7049.

[3] Yamasaki A, Kameda C, Xu R,et al. Nuclear factor kappaB-activated monocytes contribute to pancreatic cancer progression through the production of Shh. Cancer Immunol Immunother,2010, 59:675-686.

[4] Thayer SP,di Magliano MP,Heiser PW,et al.Hedgehog is an early and late mediator of pancreatic cancer tumorigenesis.Nature,2003,425:851-856.

[5] Quint K,Stintzing S,Alinger B,et al.The expression pattern of PDX-1,SHH, Patched and Gli-1 is associated with pathological and clinical features in human pancreatic cancer. Pancreatology,2009,9:116-126.

[6] 王云鋒,滿曉華,高軍，等. SUFU在胰腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義.中華胰腺病雜志,2010,6:418-420.

[7] Melisi D, Xia Q, Paradiso G,et al. Modulation of pancreatic cancer chemoresistance by inhibition of TAK1. J Natl Cancer Inst,2011,103: 1190-1204.

[8] Kasperczyk H, Baumann B, Debatin KM, et al. Characterization of sonic hedgehog as a novel NF-kappaB target gene that promotes NF-kappa B-mediated apoptosis resistance and tumor growth in vivo. FASEB J,2009,23:21-33.

ExpressionandclinicalsignificanceofShh,Gli1,Sufu,TAK1,p-TAK1proteininpancreaticcarcinoma

MADan,MANXiao-hua,GAOJun,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:LIZhao-shen.Email:Iizhaoshen111@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of Hedgehog signaling pathway members, Shh, Gli1, Sufu and TAK1 as well as phosphorylation-TAK1(p-TAK1) protein in human pancreatic carcinoma tissues and to explore its relationship between the expression of proteins and the clinicopathologic parameters.MethodsThe expressions of Shh, Gli1, Sufu, TAK1, p-TAK1 proteins in 38 samples of pancreatic cancer tissues and pairing adjacent normal pancreatic tissues were detected by immunohistochemical method．The relationship among the proteins and the relationship between the expression of the proteins and the clinicopathologic parameters were examined．ResultsThe positive expression rates of Shh, Gli1, Sufu, TAK1, p-TAK1 protein in human pancreatic carcinoma were 86.8%(33/38), 52.6%(22/38), 68.4%(26/38), 55.3%(21/38), 52.6%(20/38), but they were not expressed in adjacent normal pancreatic tissues. Gli1 expression was positively related to distant metastasis and clinical staging (r=0.524, 0.361,P<0.05), Sufu expression was positively related to patient′s gender (r=-0.378,P<0.05), TAK1 expression was positively related to clinical staging (r=0.468,P<0.05), p-TAK1 expression was positively related to clinical staging and distant metastasis (r=0.418, 0.361,P<0.05). Gli1 expression was positively related to TAK1 and p-TAK1 expression in pancreatic cancer tissues (P<0.05).ConclusionsHedgehog signaling pathway and p-TAK1 may play a role in the pathogenesis of pancreatic cancer, and the two pathways may interact with each other.

Pancreatic neoplasm; Immunohistochemistry; Hedgehog signal pathway; Mitogen-activated protein kinase kinases

2013-03-18)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.008

重大國(guó)際合作項(xiàng)目(30910103911)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申：Email:Iizhaoshen111@yahoo.com.cn