連接黏附分子C單抗對小鼠急性壞死性胰腺炎肝損傷的保護(hù)作用

胡端敏 楊勇 唐文

連接黏附分子C單抗對小鼠急性壞死性胰腺炎肝損傷的保護(hù)作用

胡端敏 楊勇 唐文

重癥急性胰腺炎(SAP)往往伴有多器官的功能損傷，其中肝臟的損傷十分多見，且肝功能損害程度對預(yù)測SAP預(yù)后尤為重要。SAP導(dǎo)致的炎癥細(xì)胞過度激活和在肝臟組織的浸潤是肝功能損傷的重要機(jī)制[1]，其中細(xì)胞黏附分子粘附于炎癥細(xì)胞的過程,對白細(xì)胞過度激活以及SAP時(shí)臟器損傷的發(fā)生、發(fā)展有重要意義。連接黏附分子C(junctional adhesion molecule-C, JAM-C)是近年新發(fā)現(xiàn)的在血管內(nèi)皮細(xì)胞上分布的細(xì)胞黏附分子，它介導(dǎo)中性粒細(xì)胞向炎癥部位和組織損傷處浸潤和聚集[2]。本研究組前期的研究發(fā)現(xiàn)，JAM-C在急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)小鼠全身主要器官的表達(dá)明顯增高[3]。本研究應(yīng)用抗JAM-C單抗干預(yù)ANP小鼠，觀察抑制了JAM-C介導(dǎo)的粘附作用對ANP小鼠肝損傷的影響。

一、材料和方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：清潔級(jí)昆明小鼠18只，雌雄不分，體質(zhì)量(20±2)g，購自蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。按完全隨機(jī)法將小鼠分為對照組、ANP組、JAM-C單抗處理組(抗體組)，每組6只。采用腹腔注射雨蛙素(50 μg/kg體質(zhì)量，美國Sigma公司)6次，間隔1 h的方法制備ANP模型，末次注射后立即腹腔注射內(nèi)毒素10 mg/kg體質(zhì)量?？贵w組以同樣方法制備ANP模型，同時(shí)在首次注射雨蛙素30 min后腹腔內(nèi)注射羊抗小鼠JAM-C單抗0.3 ml(300 μg，美國R&D公司)，末次雨蛙素注射后腹腔內(nèi)注射內(nèi)毒素10 mg/kg體質(zhì)量。

2．血清酶學(xué)和TNF-α濃度測定：在末次注射后3 h，心臟穿刺收集血液，應(yīng)用OLYMPUS全自動(dòng)生化儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和淀粉酶活性，采用ELISA法測定血清TNF-α水平，ELISA試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，操作步驟均嚴(yán)格按照說明書。

3．胰腺、肝臟組織病理檢查：取血后用頸椎脫臼法處死小鼠，開腹取胰腺及肝臟組織，置10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察。按Schmidt等[4]和Mota等[5]的標(biāo)準(zhǔn)分別對胰腺和肝臟組織行病理學(xué)評分。

二、結(jié)果

1．胰腺病理變化及評分：對照組胰腺組織正常(圖1)。ANP組胰腺高度水腫，腺泡呈孤島狀，廣泛腺細(xì)胞壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清，胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，局部有融合性壞死灶，壞死區(qū)有大量中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(圖1)，胰周脂肪壞死，有大量炎癥細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張充血，間質(zhì)內(nèi)動(dòng)脈痙攣，靜脈明顯擴(kuò)張淤血，炎癥細(xì)胞附邊，局部血管壁出血、壞死?？贵w組胰腺間質(zhì)充血水腫，有中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，少量局灶性腺泡壞死，血管病變不明顯，無出血(圖1)。對照組、ANP組、抗體組胰腺病理評分分別為0、(9.3±1.3)、(6.2±1.1)分，抗體組評分較ANP組顯著降低(P<0.05)。

2．肝臟病理變化及評分：對照組肝臟組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常(圖1)。ANP組肝臟充血，肝小葉內(nèi)肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞廣泛空泡樣變性，肝血竇內(nèi)充滿紅細(xì)胞，門管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(圖1)。抗體組肝細(xì)胞腫脹明顯，散在空泡樣變性，少量炎細(xì)胞浸潤(圖1)。對照組、ANP組、抗體組肝臟組織病理評分分別為0、(7.8±1.6)、(5.2±1.1)分，抗體組評分較ANP組顯著降低(P<0.05)。

圖1對照組(a)、ANP組(b)、抗體組(c)胰腺(左)和肝臟(右)的病理變化(HE ×100)

3．血清ALT、AST、淀粉酶、TNF-α水平的變化：對照組、ANP組、抗體組的ALT分別為(40±5)、(121±26)、(85±16)U/L；AST分別為(118±18)、(386±42)、(258±36)U/L；淀粉酶分別為(1876±245)、(17985±1064)、(13870±988)U/L；TNF-α分別為(58±13)、(628±48)、(320±23)ng/L。ANP組各指標(biāo)均顯著高于對照組，抗體組各指標(biāo)均較ANP組顯著降低，但仍顯著高于對照組(P值均<0.05)。

討論JAM-C是免疫球蛋白超家族成員之一，它主要分布在白細(xì)胞、血小板、各種上皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞上。在腹膜炎[6]、肺炎[7]、皮膚炎癥[8]、關(guān)節(jié)炎[9]等動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)JAM-C增加了中性粒細(xì)胞在炎癥部位和組織損傷處的浸潤和聚集。

Rau等[10]使用細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)單抗預(yù)處理ANP大鼠，結(jié)果有效地減少了ANP大鼠胰腺內(nèi)的白細(xì)胞浸潤，明顯降低了胰腺炎癥的病理評分，抑制了胰腺的早期壞死和后期的細(xì)胞凋亡。Hartwig等[11]報(bào)道，阻斷黏附分子L選擇素的表達(dá)能明顯降低白細(xì)胞滲出和肺損害。這些研究的重點(diǎn)主要是針對介導(dǎo)白細(xì)胞趨邊、滾動(dòng)和初步粘附的分子。JAM-C主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接上，它的配體主要是分布在各種白細(xì)胞上的整和素Mac-1(αLβ2、CD11b/CD18)。正是由于這種細(xì)胞膜分布上的特異性，JAM-C在白細(xì)胞激活向炎癥區(qū)域募集的過程中主要作用于白細(xì)胞的跨壁穿越過程。Chavakis等[12]使用JAM-C的可溶形式(sJAM-C)結(jié)合中性粒細(xì)胞上的整和素Mac-1后，發(fā)現(xiàn)血管炎癥明顯減輕，且白細(xì)胞滲出也明顯減少。Scheiermann等[13]報(bào)道，拮抗JAM-C能使缺血再灌注損傷小鼠的中性粒細(xì)胞血管外滲明顯減少。Vonlaufen等[14]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)JAM-C的轉(zhuǎn)基因小鼠制備ANP模型后胰腺和肺組織炎癥損傷明顯重于正常小鼠制備的ANP模型。本研究結(jié)果顯示，JAM-C單抗處理后的ANP小鼠胰腺和肝臟組織的病理損傷明顯減輕，血清ALT、AST、淀粉酶水平顯著下降，同時(shí)血TNF-α水平亦顯著下降。因TNF-α是ANP合并全身炎癥反應(yīng)綜合征的主要炎癥因子，與急性胰腺炎的臨床預(yù)后密切相關(guān)[15]，故用抗體中和JAM-C后不僅能減輕ANP小鼠胰腺和肝臟組織的炎癥損傷，還可能有效緩解全身炎癥反應(yīng)。因此，阻斷參與ANP后期細(xì)胞事件的黏附分子JAM-C可能成為治療ANP肝損傷的有效治療方法。

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2013-05-15)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.017

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