吡格列酮對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺細(xì)胞凋亡的作用

徐萍 婁曉麗 陳誠(chéng)

·論著·

吡格列酮對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺細(xì)胞凋亡的作用

徐萍 婁曉麗 陳誠(chéng)

目的探討吡格列酮在重癥急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制中與凋亡激活的關(guān)系。方法將80只SD大鼠按隨機(jī)表法分為急性壞死性胰腺炎組(ANP組)、假手術(shù)組、二甲基亞砜溶劑對(duì)照組(DMSO組)、吡格列酮干預(yù)組(吡格列酮組)，每組20只。采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c1 ml/kg體質(zhì)量的方法制作ANP模型，吡格列酮組在造模前30 min腹腔注射吡格列酮40 mg/kg體質(zhì)量。術(shù)后1、3、6、12 h分批處死大鼠，收集胰腺組織。采用常規(guī)HE染色進(jìn)行胰腺組織病理評(píng)分，采用TUNEL染色方法檢測(cè)大鼠胰腺細(xì)胞凋亡，免疫組化法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胰腺組織PPARγ的表達(dá)變化，同時(shí)檢測(cè)胰腺組織caspase 3的表達(dá)變化。結(jié)果吡格列酮干預(yù)后大鼠胰腺組織病理損傷較ANP組大鼠有所減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。吡格列酮組胰腺組織PPARγ表達(dá)水平為2.69±0.46，顯著高于ANP組的0.75±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。吡格列酮3 h組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)為8.35±0.95，顯著高于同時(shí)點(diǎn)ANP組的4.37±1.22；caspase 3的活性為9.24±1.78，顯著高于ANP組的5.04±0.86，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。結(jié)論吡格列酮干預(yù)后大鼠胰腺炎癥減輕，PPARγ和caspase 3表達(dá)升高，胰腺細(xì)胞凋亡率升高。

胰腺炎，急性壞死性； 噻唑烷二酮類； 吡格列酮； PPARγ； 細(xì)胞凋亡

對(duì)于重癥急性胰腺炎(SAP)的發(fā)病特點(diǎn)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為炎癥反應(yīng)與胰腺細(xì)胞的凋亡有著密切聯(lián)系[1]。吡格列酮屬噻唑烷二酮(TZDs)類化合物，為高選擇性過氧化物酶增殖體激活受體γ(peroxisone proliferators activated receptors,PPARγ)激動(dòng)劑，具有明顯的抗炎和雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)[2-3]。細(xì)胞凋亡與急性胰腺炎(AP)病程及預(yù)后密切相關(guān)，其可能發(fā)揮的有利作用為治療SAP提供了新思路[4]。本研究應(yīng)用吡格列酮干預(yù)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，探討吡格列酮與胰腺細(xì)胞凋亡激活的關(guān)系。

材料和方法

一、動(dòng)物模型建立及分組

80只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，清潔級(jí)，鼠齡2～2.5個(gè)月，體質(zhì)量160～200 g，由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。按隨機(jī)表法分為ANP組、假手術(shù)組、二甲基亞砜(DMSO)組和吡格列酮組，每組20只。采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c1 ml/kg體質(zhì)量的方法制作ANP模型。假手術(shù)組只翻動(dòng)胰腺并以鈍器輕劃胰腺3次后關(guān)腹。吡格列酮組在制模前30 min腹腔注射DMSO溶解的吡格列酮40 mg/kg體質(zhì)量。DMSO組在制模前腹腔注射等容積DMSO。術(shù)后1、3、6、12 h分批處死大鼠，取胰頭部組織，部分用10%中性緩沖甲醛固定，部分液氮保存。

二、指標(biāo)檢測(cè)

1．胰腺組織病理檢查：固定的胰頭部組織常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，在光鏡下觀察胰腺組織病理改變，每片隨機(jī)選取8～10個(gè)高倍視野，采用Schimidt等[5]標(biāo)準(zhǔn)從水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血、壞死程度4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分， 4個(gè)評(píng)分相加為總評(píng)分。

2．胰腺組織PPARγ蛋白表達(dá)檢測(cè)： 取6 h組的胰腺石蠟包埋組織，切片，采用免疫組化方法檢測(cè)PPARγ蛋白表達(dá)，計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞的百分率。另取凍存的胰腺組織100 μg，提取總蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PPARγ蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，以PPARγ條帶與β-actin條帶灰度比值作為蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

3．胰腺組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取胰腺石蠟包埋組織，切片，采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。TUNEL原位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碩盟有限公司，按說明書操作。取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞的凋亡指數(shù)。

4．胰腺組織caspase 3活性的檢測(cè)：取凍存的胰腺組織，提取總蛋白，采用分光光度法檢測(cè)caspase 3活性，嚴(yán)格按試劑盒(上海碩盟有限公司)說明書操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組胰腺組織病理學(xué)改變

假手術(shù)組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，大部分腺泡小葉完整，偶見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見間質(zhì)充血、出血和腺泡細(xì)胞壞死；ANP組大鼠胰腺組織可見腺泡細(xì)胞變性、壞死，小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，小葉間質(zhì)水腫，片狀出血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；吡格列酮組大鼠胰腺組織未見腺泡細(xì)胞壞死，小葉結(jié)構(gòu)存在，部分間質(zhì)水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見點(diǎn)狀出血(圖1)。ANP組的胰腺病理評(píng)分較假手術(shù)組及DMSO組顯著增加，吡格列酮組的胰腺病理評(píng)分較ANP組顯著降低，但仍顯著高于假手術(shù)組和DMSO組(P值均<0.05，表1)。

二、各組胰腺組織PPARγ蛋白表達(dá)

PPARγ主要定位于胰腺腺泡細(xì)胞的胞核，出現(xiàn)棕色顆粒為陽性表達(dá)(圖1)。假手術(shù)組、ANP組、吡格列酮組大鼠胰腺組織PPARγ表達(dá)量分別為30.19±3.01、13.28±1.53、44.06±7.55；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)的上述各組PPARγ的表達(dá)量分別為1.34±0.09、0.75±0.05、2.69±0.46(圖2)。ANP組大鼠術(shù)后胰腺PPARγ表達(dá)水平與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但吡格列酮組大鼠胰腺PPARγ表達(dá)水平顯著高于ANP組大鼠(F=10.442，P=0.004)。

圖1假手術(shù)組(上)、ANP組(中)、吡格列酮組(下)大鼠術(shù)后6 h時(shí)胰腺組織的病理改變(左，HE ×400)及PPARγ的表達(dá)(右，免疫組化 ×400)

表1 各組大鼠胰腺組織的病理評(píng)分

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

三、各組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡及caspase 3的活性

ANP組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡及caspase 3活性均較假手術(shù)組顯著增加，吡格列酮組胰腺的細(xì)胞凋亡及caspase 3活性又均較ANP組顯著增加(P值均<0.05，圖3，表2、3)。

圖2假手術(shù)組(1)、ANP組(2)、吡格列酮組(3)大鼠術(shù)后6 h時(shí)胰腺PPARγ的表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

圖3假手術(shù)組(a)、ANP組(b)、吡格列酮組(c)大鼠術(shù)后6 h時(shí)胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡(TUNEL法 ×400)

表2 各組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡指數(shù)

表3 各組大鼠胰腺組織caspase3的活性變化

討 論

SAP發(fā)病早期，胰腺組織常出現(xiàn)明顯的出血壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[4]。周杰等[5]研究發(fā)現(xiàn)，重癥胰腺炎細(xì)胞主要以壞死為主，慢性胰腺炎則以凋亡的形式清除細(xì)胞。Wang等[6]研究提示，胰腺腺泡細(xì)胞的不同死亡方式在胰腺疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞凋亡可減輕胰腺炎癥反應(yīng)。

吡格列酮是PPARγ激動(dòng)劑，可雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，同時(shí)能夠減輕炎癥反應(yīng)[7-10]。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮干預(yù)ANP大鼠時(shí)，其通過活化caspase 3，抑制NF-κB p65表達(dá)，阻遏肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等抗炎機(jī)制從而抑制實(shí)質(zhì)細(xì)胞的過度凋亡[11]。Masamune等[12]利用人胰腺腺泡細(xì)胞AR42J建立了AP細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)吡格列酮能促進(jìn)胰腺細(xì)胞的凋亡從而減輕炎癥。本研究結(jié)果顯示，吡格列酮干預(yù)后，大鼠胰腺組織病理評(píng)分明顯下降，PPARγ表達(dá)升高，胰腺組織的凋亡明顯升高，說明吡格列酮通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減輕胰腺組織的炎癥，從而減輕胰腺組織的病理損傷。與上述研究結(jié)果一致。

邵宏偉等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在急性單純水腫性胰腺炎時(shí)極少有腺泡細(xì)胞凋亡，AP的嚴(yán)重程度與腺泡細(xì)胞的凋亡率在程度較輕的急性出血壞死性胰腺炎時(shí)呈正相關(guān)，而在程度較重的急性出血壞死性胰腺炎時(shí)則呈負(fù)相關(guān)。本結(jié)果顯示，吡格列酮能夠促進(jìn)ANP大鼠胰腺細(xì)胞的凋亡，同時(shí)激活PPARγ和caspase 3，減輕胰腺的炎癥反應(yīng)，對(duì)ANP具有一定的保護(hù)作用。

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Effectofpioglitazoneonpancreaticapoptosisinratswithacutenecrotizingpancreatitis

XUPing,LOUXiao-li,CHENCheng.

DepartmentofGastroenterology,SongjiangBranch,ShanghaiFirstPeople′sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai201600,China

Correspondenceauthor:XUPing,Email:sjzxxp@yeah.net

ObjectiveTo investigate the effect of pioglitazone on the activation of pancreatic apoptosis in the pathogenesis of rats with acute necrotizing pancreatitis.MethodsEighty Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups, including acute necrotizing pancreatitis (ANP), sham operation (SO), solvent control (Solvent), pioglitazone intervention (pioglitazone)group, with 20 rats in each group. ANP model was induced by retrograde injection of 4% sodium taurocholate (1ml/kg body weight) into the biliary-pancreatic duct. The rats in pioglitazone group were injected pioglitazone (40 mg/kg body weight) into the ANP abdominalcavity 30 min before mldel induction. The rats were sacrificed at 1 h, 3 h, 6 h, and 12 h after ANP model induction. The pancreatic tissues were harvested. Routine HE staining was used to evaluate pancreatic pathological damage. The apoptosis was determined by TUNEL method. The expression of PPARγ was determined by using immunohistochemistry and Western-blot methods. The activity of caspase3 in pancreatic tissues was detected by using spectrophotometry.ResultsThe pancreatic pathological damage was attenuated in rats in pioglitazone group compared with that in rats of ANP group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). The PPARγ expression of pioglitazone group was 1.34±0.09, which was significantly higher than that in ANP group (0.75±0.05), and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). The apoptotic index in pioglitazone group at 3 h was 8.35±0.95, which was significantly higher than that in ANP group at 3 h (4.37±1.22); the caspase3 activity was 9.24±1.78, which was significantly higher than that in ANP group (5.04±0.86), and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05).ConclusionsPioglitazone intervention attenuates pancreatic inflammation, increases PPARγ expression and caspase3 activity and induces apoptosis in pancreas of rats with acute necrotizing pancreatitis.

Pancreatitis, acute necrotizing; Thiazolidinediones; Pioglitazone; PPAR gamma; Apoptosis

2013-06-12)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.010

2010年上海市自然科學(xué)基金(10ZR1427900)；上海市松江區(qū)領(lǐng)先合作項(xiàng)目(2011LX01)

201600 上海，上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院松江分院 松江區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科(徐萍、陳誠(chéng))，中心實(shí)驗(yàn)室(婁曉麗)

徐萍， Email: sjzxxp@yeah.net