靶向人DcR3的microRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

周健 何宋兵 宋世鐸 朱東明 李德春 張子祥

·短篇論著·

靶向人DcR3的microRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

周健 何宋兵 宋世鐸 朱東明 李德春 張子祥

誘騙受體3(decoy receptor ,DcR3)屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員，是一種凋亡抑制蛋白[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，DcR3基因的表達(dá)與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)[2-3]。microRNA(miRNA)干擾技術(shù)以其高效、特異的優(yōu)勢，已經(jīng)成為一種有效的基因沉默工具。我們前期的實(shí)驗研究表明，DcR3基因在人胰腺癌組織和外周血中高表達(dá)，并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。本研究構(gòu)建靶向DcR3基因的miRNA表達(dá)載體，為胰腺癌的基因治療提供一個新的靶點(diǎn)。

一、材料與方法

1．靶向DcR3的miRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)GenBank中DcR3的基因序列(NM_003823)，設(shè)計2個靶向DcR3的miRNA。 DcR3-miRNA-1模板包括正義鏈5′-GTCATC-GACTTTGTGGCTTTC-3′，反義鏈5′-GAAAGCCACAAAGTC-GATGACG-3′，loop區(qū)5′-AGTGAAGCCACAGATGTA-3′；DcR3-miRNA-2模板包括正義鏈5′-TACACGCAGTTCTGGAACTAC-3′，反義鏈5′-TACACGCAGTTCTGGAACTAC-3′，loop區(qū)5′-AGTGAAGCCACAGATGTA-3′。2個DcR3-miRNA及陰性對照miRNA(shRNA-C)設(shè)計及合成均由上海Genechem公司完成。將兩條模板單鏈退火形成雙鏈，插入經(jīng)Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后形成的線性化質(zhì)粒載體pP-EGFP-miRNA，形成重組質(zhì)粒pP-EGFP-DcR3-miRNA-1、pP-EGFP-DcR3-miRNA-2。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli TOP10細(xì)菌，在含有壯觀霉素的LB瓊脂糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h。挑取陽性克隆，小量提取質(zhì)粒，經(jīng)Xho Ⅰ和EcoRⅠ雙酶切后電泳分離鑒定質(zhì)粒，并送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。測序正確的2個重組質(zhì)粒分別命名為DcR3-miRNA-1、DcR3-miRNA-2

2．質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞：人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1細(xì)胞為本實(shí)驗室保存，常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的PANC1細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，每孔1×105細(xì)胞，分成空白對照組、陰性質(zhì)粒對照組、DcR3-miRNA-1組和DcR3-miRNA-2組。培養(yǎng)16 h后采用脂質(zhì)體Lipofectnmine 2000將相應(yīng)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在熒光顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)情況。

3．轉(zhuǎn)染細(xì)胞DcR3 mRNA表達(dá)的檢測： 采用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。DcR3探針5′-FAMCTCCTCAGCTCCTGGTACCCTTAMRA-3′，上游引物5′-CTC-TTCCTCCCATGACAC-3′，下游引物5′-CTGGAAAGCCAC-AAAGTC-3′，產(chǎn)物112 bp；內(nèi)參β-actin探針5′-FAMTTG-AGACCTTCAACACCCCAGCCTAMRA-3′，上游引物5′-CGTGAAAAGATGACCCAGATCA-3′，下游引物5′-CAGCCTGGA-TGGCTACGTACA-3′，產(chǎn)物96 bp。DcR3的定量采用Taq酶探針法，PCR擴(kuò)增條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，共40個循環(huán)，72℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt公式計算mRNA表達(dá)量(ΔCt=Ct目的基因-Ctactin,ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt陰性對照)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線成像、攝影。

4．轉(zhuǎn)染細(xì)胞DcR3蛋白表達(dá)的檢測：收集轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白，BCA法測蛋白濃度，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測DcR3蛋白表達(dá)。鼠抗人DcR3單抗購自Abcom公司，工作濃度1∶300。最后ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像和掃描分析，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參。

二、結(jié)果

1．重組質(zhì)粒鑒定及測序：重組質(zhì)粒DcR3-miRNA-1和DcR3-miRNA-2雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示約400 bp左右條帶，與預(yù)期值416 bp一致。空白對照未見條帶，陰性對照質(zhì)粒見約1215 bp條帶(圖1)。測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒序列與所設(shè)計的基因序列完全相符(圖2)。

1：空白對照；2：陰性對照質(zhì)粒；M：Marker；3～4：DcR3-miRNA-1；5～6：DcR3-miRNA-2

圖1重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖

圖2 重組質(zhì)粒的測序圖

2．重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞：pP-EGFP質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白(GFP)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞后，陰性質(zhì)粒對照轉(zhuǎn)染細(xì)胞、重組質(zhì)粒DcR3-miRNA-1、DcR3-miRNA-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞均有綠色熒光蛋白表達(dá)，約占細(xì)胞總數(shù)的80%，空白對照細(xì)胞未見綠色熒光(圖3)。

a：空白對照；b：陰性對照質(zhì)粒；c：DcR3-miRNA-1；d：DcR3-miRNA-2

3． 轉(zhuǎn)染細(xì)胞DcR3 mRNA的表達(dá)：2個轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞的DcR3 mRNA表達(dá)均較轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的細(xì)胞及空白對照細(xì)胞明顯下降(P﹤0.01)，2個轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞的DcR3 mRNA表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后均可在112 bp及96 bp對應(yīng)位置見清晰的條帶，與預(yù)期相符，但轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒2組的條帶較淺(圖4)。

4．轉(zhuǎn)染細(xì)胞DcR3蛋白的表達(dá)：2個轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞的DcR3蛋白表達(dá)均較轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的細(xì)胞及空白對照細(xì)胞明顯下降(P﹤0.05) ，其中轉(zhuǎn)染DcR3-shRNA-2細(xì)胞的抑制效果更明顯，抑制率為76.8%(圖5)。

討論DcR3又稱TR6或M68，是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員，DcR3與腫瘤壞死因子家族中的骨保護(hù)素(OPG)、TNFR2、Fas分別具有31%、29%和17%的序列同源性[5]。DcR3具有抑制凋亡和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的雙重功能，能競爭性結(jié)合Fas配體(FasL)、腫瘤壞死因子樣配體1A(TL1A)和T細(xì)胞上可誘導(dǎo)表達(dá)的、與單純皰疹病毒糖蛋白D競爭結(jié)合單純皰疹病毒侵入介體的淋巴毒素類似物(LIGHT)，從而阻斷它們所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6-8]。此外，DcR3在T細(xì)胞和DC細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮著重要的作用[9-10]。在多種人類惡性腫瘤如胃癌、結(jié)腸癌、食道癌、肺癌、肝癌中均能檢測出DcR3的高表達(dá)[5,11-14]。因此，DcR3可以作為腫瘤基因治療的良好靶點(diǎn)。

與空白對照組和陰性對照組比較，aP<0.01

與空白對照組和陰性對照組比較，aP<0.05

RNA干擾(RNAi)已被證明是一種強(qiáng)大而有效的實(shí)驗工具，通過與靶基因結(jié)合沉默目的基因的表達(dá)。RNAi主要包括兩類，即siRNA和miRNA。miRNA是繼siRNA之后研究較為深入的又一類長20～24 nt的小分子非編碼RNA，它廣泛存在于真核生物中，不具有開放閱讀框架，不編碼蛋白質(zhì)，具有高度保守性、基因表達(dá)時序性和組織特異性[15-16]。miRNA調(diào)控靶基因方式有3種：(1)miRNA與目的基因完全互補(bǔ)結(jié)合，作用方式及功能與siRNA非常相似，切割和降解mRNA[17]。(2)miRNA與目的基因不完全互補(bǔ)，抑制蛋白質(zhì)翻譯而不影響mRNA穩(wěn)定[18]。(3)miRNA誘導(dǎo)目的基因快速脫腺苷化，從而導(dǎo)致mRNA的表達(dá)水平下降[19]。因此，miRNA在精準(zhǔn)調(diào)控基因上可能有著非常重要的作用。

在miRNA的加工過程中，影響Drosha酶剪切的因素為其二級結(jié)構(gòu)，與miRNA一級序列無關(guān)，這為通過替換天然的miRNA的靶序列、構(gòu)建靶向特定靶點(diǎn)的人工miRNA提供重要的理論依據(jù)[20]。本研究中我們針對人DcR3的基因序列，設(shè)計靶向DcR3的兩條miRNA序列， 5′及3′側(cè)翼區(qū)來源于miRNA30轉(zhuǎn)錄本，反向互補(bǔ)的21 nt轉(zhuǎn)錄后形成靶向mRNA的核心序列，兩端設(shè)計的非互補(bǔ)的黏性末端與線性化質(zhì)粒連接，避免連接方向錯誤等問題，并通過BLAST對其進(jìn)行特異性分析，確認(rèn)與人類其他基因無同源序列。使用的干擾載體為pP-EGFP-miR質(zhì)粒，是特殊設(shè)計的表達(dá)miRNA并且含有miR側(cè)翼的序列，該質(zhì)粒含有PolⅡ啟動子，是一種人的巨細(xì)胞病毒早期啟動子，可高水平表達(dá)miRNA，在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，并且可以使用組織特異性誘導(dǎo)型啟動子，從而有利于脫靶效應(yīng)的控制。

本實(shí)驗設(shè)計并構(gòu)建了靶向DcR3的miRNA表達(dá)載體，經(jīng)電泳及測序證實(shí)載體構(gòu)建成功，應(yīng)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC1細(xì)胞，通過RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法驗證針對DcR3的抑制效率，發(fā)現(xiàn)兩個重組質(zhì)粒均能在mRNA和蛋白水平抑制胰腺癌PANC1細(xì)胞DcR3的表達(dá)，且DcR3-miRNA-2的干擾效果更佳，證實(shí)了該質(zhì)粒可用于靶向DcR3的胰腺癌基因治療的研究。

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2012-11-14)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.016

國家自然科學(xué)青年科學(xué)基金項目(81201905)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃( CXLX11_0088)

215000 蘇州，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科

張子祥，Email：skysuzhou0612@gmail.com