細胞周期的測定方法

曲笑瑩，高世勇

(1.哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心，哈爾濱150076;2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076)

連續(xù)分裂的細胞從上一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂完成所經歷的整個過程為細胞周期.整個細胞周期可分為間期和有絲分裂期，M期即為有絲分裂期，是染色體真正開始分離時期.間期又可進一步細分為G1期、S期、G2期三個時相.G1期為DNA合成前期，該期是從第一次細胞分裂完成到DNA復制開始之前的間隙時間.有些細胞進入G1期后也可能出現暫不增殖的情況，這種不進入周期的細胞被稱為G0期細胞.S期為DNA合成期，在該時相，組蛋白、非組蛋白及各種酶類進行大量的合成.G2期為DNA合成后期，這一時期主要為細胞有絲分裂準備物質條件.

細胞分裂完成一個周期的時間稱為細胞的倍增時間，測定細胞倍增時間和各時期時長在研究細胞同步化、細胞動力學、藥物在體外作用的前期實驗等方面具有重要作用.

1 細胞周期測定應用

1.1 同步化應用

應用CCK－8法測定細胞倍增時間，以確定細胞同步化試劑的給藥時長.取培養(yǎng)的JEC細胞進行消化、離心、重懸、計數，接種于96孔板，分成6組.培養(yǎng)24 h后每隔2～4 h加入CCK－8，置于37℃、5%CO2恒溫孵育2 h，酶標儀檢測吸光度(A)值，直至A值升至基點時A值的2倍，得細胞倍增時間[1].在細胞同步化過程中測定細胞倍增時間可以提高對細胞同步的精確度，使細胞同步率達到更高的水平.

1.2 臨床應用

S+G2+M期反映了細胞增殖狀態(tài)，在白血病治療前，患者骨髓細胞在S期和G2/M期比例減少[2－3]，G0/G1期比例升高，表明白血病細胞增值活性低于正常[4].在臨床上測定細胞群體的各時期分布和倍增時間，可以了解細胞DNA含量、細胞增殖等特性，對指導治療、判斷和預后有重要意義.

苑錦英等[5]對肝癌的細胞周期比例與名種常用化療藥物敏感性的關系進行了研究發(fā)現，細胞周期的改變與化療藥物的敏感性改變相關.肝癌細胞周期比例與化療藥物抑制率之間有明顯關系，各種化療藥物對肝癌抑制率上的差異可以通過肝癌細胞周期比例上的不同需反映出來，對于提高腫瘤的化療效果具有重要的臨床指導意義.

1.3 藥代動力學應用

在動物實驗中測定細胞倍增時間，有助于對動物細胞動力學方面的研究.高鳳鳴等[6]在對小鼠骨髓造血細胞動力學研究的基礎上，對大鼠骨髓造血細胞細胞周期及其各有關時相的持續(xù)時間進行了研究.

2 總倍增時間測定方法

2.1 生長曲線法

利用生長曲線法測定細胞倍增時間的方法，分為作圖法和公式法兩種[7]，都是通過細胞計數或者其他方法檢測每生長24 h的細胞總數繪制細胞生長曲線圖.如圖1所示.

圖1 生長曲線

作圖法是從圖1中對數期任意兩截點所表示的細胞數和變化時間計算出細胞生長速率，從而得出倍增時間.

公式法是通過式(1)計算倍增時間.

其中:Td為倍增時間，Δt為計數間隔天數，Nt為對數生長期任一點的理論觀察值，N0為對數生長期理論初始值.但由于細胞計數存在誤差，使計算出的每天的倍增時間差異較大，不夠精確，目前多采用建立生長曲線的擬合曲線，并用倍增公式推導簡化來的公式(2)進行計算，可得到較準確地對數期倍增時間[8].

其中:Td為倍增時間，b1為式(1)簡化系數.在實際操作中，細胞生長狀態(tài)會因外界環(huán)境發(fā)生一定改變，個人實驗操作手法不同導致細胞計數產生誤差，都會對結果產生影響，所以計數繪制生長曲線法只能大致計算出細胞的倍增時間，如果想要更精確的結果，還要通過其他方法進行.

2.2 3 H－TdR脈沖標記法

3H－TdR脈沖標記DNA復制和細胞分裂指數觀測法，是最經典的測定細胞周期各時相時間的方法[9]，它是利用3H－TdR(胸腺嘧啶核苷)摻入DNA和放射自顯影計數，通過在體外采用3H標記的胸腺嘧啶核苷酸脈沖標記，隨后，每個一定時間取樣做細胞放射自顯影，找出正處于有絲分裂的細胞，計算其中帶有3H標記的細胞占有絲分裂細胞的百分比，繪制曲線，即可大致確定細胞倍增時間.此方法適用于細胞運行時間短，周期運轉均勻的細胞群體.

3H－TdR脈沖標記法需要用到放射性同位素，對細胞周期有一定影響，且在細胞群類較為復雜時不適用.由于放射性同位素在實驗中易造成污染，所以此法目前使用較少.

2.3 BrdU摻入聯合流式細胞術法

通過測定S期細胞比例及S期持續(xù)時間，求得細胞倍增時間[10].在培養(yǎng)的細胞中摻入5－溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU，可代替胸腺嘧啶摻入S期細胞)，在特定時間點通過流式細胞術檢測S期細胞比例，通過觀察S期細胞比例的增長趨勢和線性關系的改變，確定S期持續(xù)時間.認為細胞進入和流出S期速率相同，則TS/S%=Tc(Tc為倍增時間).

由于流式細胞術操作簡便，結果相對準確全面，目前應用其測定細胞周期較多.

2.4 MTT法/CCK－8法

MTT分析法以活細胞代謝物還原劑MTT噻唑藍為基礎，生成僅活細胞可產生的藍色結晶，在DMSO中溶解，利用酶標儀測定OD值，反映出活細胞數目.接種孔板后，當細胞生長到對數期，用MTT比色法測定起始OD值，24 h后取特定時間點檢測，當OD值為起始OD值2倍時即為倍增時間.CCK－8法是MTT升級方法，所用試劑相比MTT更易操作，更穩(wěn)定，靈敏度更高.檢測方法與MTT法類似[1].

此類方法操作簡單，靈敏度高、經濟，但可能由于如操作不熟練、DMSO細胞毒性、結晶易被洗去等原因，導致結果波動較大.

3 各時期測定方法

3.1 3 H－TdR標記放射自顯影

通過測定有絲分裂百分比的變化可以推斷各個時相的長度，推斷如圖2所示[11].

圖2 放射自顯影法推斷周期

3.2 作圖法

應用作圖法推斷各時相長度需要得到以下四個數據[12]:1)細胞倍增時間;2)有絲分裂指數;3)S期細胞百分比;4)G2期持續(xù)時間.設定細胞進入和流出各時期的速率相同，在第一象限中作任意與x軸和y軸相交的直線，得到以上數據后作圖，結果如圖3所示.

圖3 作圖法推斷周期

根據各時相對應點找到對應到x軸上的時間點，從而得出個時相時長.

3.3 S期時長測定

細胞培養(yǎng)中摻入BrdU分別于連續(xù)增長的時間點收集細胞經處理后通過流式細胞術測定S期細胞含量[13]，作圖4.

圖4 S期時長測定

設定細胞流入和流出S期的速率相同，通過S期細胞增長所成直線的延長線與x軸相交，交點的絕對值即為S期的時長.

4 結語

細胞倍增時間和各時相時長的測定，作為一項基礎實驗，越來越被愈加嚴謹的實驗體系所重視，并且隨著技術手段的不斷提高，更精確、簡便的方便被用于實驗中.

目前出現的方法中，如CCK－8法、MTT法、生長曲線法具有操作簡便的優(yōu)點，但在操作過程中由于細胞丟失、計數等方面存在誤差，可能會對測定結果造成影響.3H－TdR脈沖標記法由于容易出現污染，已逐漸淘汰，被BrdU摻入聯合流式細胞術法所取代.流式細胞術在近幾年的研究中使用逐漸增多，技術的革新使流式細胞儀的使用更加人性化，實驗過程操作簡便，系統(tǒng)簡單易懂，數據的后期處理更加靈活全面.BrdU摻入聯合流式細胞術法能夠在短時間內精確地測定出細胞倍增時間，并通過其他條件，推斷出各個時相的時長，是目前比較常用的測定細胞周期的方法.在實驗室過程中，可依據實驗條件、實驗要求精確度來選擇細胞周期測定方法.

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