Olomoucine在匹羅卡品所致顳葉癲中的作用及機(jī)制的研究

殷亞萍 劉希金 楊志勇 鄧學(xué)軍

細(xì)胞周期依賴激酶（CDK）是一組在細(xì)胞周期調(diào)控中起著關(guān)鍵作用的蛋白激酶［1，2］，這些激酶的抑制劑在許多病理過程起著重要的作用，比如腫瘤、腎小球腎炎、增生、神經(jīng)變性等［3］。Olomoucine是一種嘌呤衍生物，也是一種細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑，它能夠通過抑制ATP與CDK的結(jié)合降低CDK1、CDK2、CDK5 的 活 性［4，5］。King and Cidlowski提出olomoucine使細(xì)胞周期停止于G1期與S期之間及G2期與M期之間，抑制了細(xì)胞的分裂和增生，同時不影響靜止期的細(xì)胞。這使細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑產(chǎn)生了一定臨床應(yīng)用價值。癲是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病并長期困擾著人類的健康，在癇間性發(fā)作之后膠質(zhì)細(xì)胞增生，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）大量表達(dá)，這成為癲的一個重要的病理過程［6，7］。星形膠質(zhì)細(xì)胞增生導(dǎo)致腺苷激酶（ADK）大量表達(dá)，在癲持續(xù)狀態(tài)后星形膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)，星形膠質(zhì)細(xì)胞中ADK表達(dá)顯著性增加并持續(xù)至少3～4個月［8］，ADK又進(jìn)一步調(diào)節(jié)突觸間隙腦內(nèi)源性止癇間劑及神經(jīng)元保護(hù)劑腺苷［9，10］，使得腺 苷 分 解 增 加，癇間 性 發(fā) 作 惡 化［11］。除了在動物實(shí)驗(yàn)中得到此項(xiàng)結(jié)果外，在顳葉癲患者顳葉皮質(zhì)中同樣發(fā)現(xiàn)了腺苷激酶的大量表達(dá)。以往的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了對細(xì)胞周期依賴激酶的抑制能減少大鼠缺血區(qū)及海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生及神經(jīng)元的死亡［12］；能抑制膠質(zhì)瘢痕的形成，減少神經(jīng)元損傷及死亡；能夠促進(jìn)動物創(chuàng)傷模型認(rèn)知功能的改善和運(yùn)動功能的恢復(fù)［13，14］。因此，本研究假設(shè)是否能夠通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生及后續(xù)ADK的過度表達(dá)來改善癲患者的癇間性發(fā)作，減輕癲患者的腦損傷。以往對癲的研究主要集中于離子通道，近年來越來越多關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能異常的研究給我們帶來了新的提示。然而對于細(xì)胞周期的干預(yù)與癲的關(guān)系我們尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠氯化鋰－匹羅卡品（Licl-Pilocarpine）所致顳葉癲模型，并用olomoucine抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，以探討細(xì)胞周期依賴激酶（CDK）抑制劑在氯化鋰－匹羅卡品（Licl-Pilocarpine）所致顳葉癲大鼠癇間性發(fā)作中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Sprague-Dawley大鼠（由華中科技大學(xué)同濟(jì)經(jīng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供），體重200～250 g（n＝140只），在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中飼養(yǎng)（光照12 h、氣溫21～22℃、濕度50%）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 氯化鋰 （Sigma-Aldrich，USA），匹羅卡品 （Sigma-Aldrich，USA）；地西泮（津藥、中國天津）、olomoucine（Axxora USA），10% 水合氯醛（中國武漢協(xié)和醫(yī)院），氯化鋰和匹羅卡品溶解于生理鹽水中。Olomoucine首先溶解于無水酒精中，之后用雙蒸水稀釋，用于實(shí)驗(yàn)的最終濃度為1 mg／ml。兔抗-ADK （1∶50in PBS中國北京博奧森生物技術(shù)有限公司），GFAP多克隆抗體 （1∶50 in PBS ProteinTech Group，Inc，USA）.

1.3 模型制備 健康雄性SD大鼠140只，隨機(jī)選出10只作為正常組，另外130只接受氯化鋰－匹羅卡品腹腔注射進(jìn)行造模。分別腹腔注射氯化鋰125 mg／kg，18 h后腹腔注射硫酸阿托品1 mg／kg，30 min后腹腔注射鹽酸匹羅卡品15 mg／kg，每30 min注射1次，直至大鼠出現(xiàn)癲持續(xù)狀態(tài)，最多注射4次。癲持續(xù)狀態(tài)持續(xù)1 h后給予安定10 mg／kg終止發(fā)作。發(fā)作程度按照Racine標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級，達(dá)到四級以上并出現(xiàn)癲持續(xù)狀態(tài)者納入實(shí)驗(yàn)。出現(xiàn)癲持續(xù)狀態(tài)的大鼠在經(jīng)歷24 h急性期后進(jìn)入潛伏期，單籠飼養(yǎng)。

1.5 行為學(xué)觀察 所觀察的行為學(xué)數(shù)據(jù)包括潛伏期、發(fā)作頻率、病死率。在藥物干預(yù)后對各組大鼠進(jìn)行視頻監(jiān)測，24 h／d，至實(shí)驗(yàn)終止。

1.6 腦電監(jiān)測 迄今為止，皮層腦電圖是應(yīng)用更多的一種腦電監(jiān)測方式，而本實(shí)驗(yàn)采用的是頭皮電極腦電圖，雖然皮層電極有著更高的準(zhǔn)確度，但是對實(shí)驗(yàn)動物的創(chuàng)傷較大。另外，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)頭皮腦電圖與皮層腦電圖所記錄的波形相似［15］，并且大鼠麻醉所使用的水合氯醛對腦電波形影響較小。實(shí)驗(yàn)大鼠用10%水合氯醛麻醉（3 mg／kg），麻醉后固定于實(shí)驗(yàn)臺，用兩根銀針作為電極置于大鼠頭皮下（兩外耳連線前0.9 cm，中線兩側(cè)1.1 cm），參考電極置于前額極（外眥連線中點(diǎn)）。在進(jìn)入慢性自發(fā)性發(fā)作階段后對大鼠進(jìn)行腦電監(jiān)測（2小時／次，3次／周），記錄腦電波形及棘波發(fā)放（SWDs）頻率。

1.7 患者篩選 在協(xié)和醫(yī)院和新華醫(yī)院（武漢）篩選出18位患者的腦組織標(biāo)本，其中12位（6男6女，18～46歲）為耐藥癲患者，作為實(shí)驗(yàn)組，篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：對丙戊酸鈉、卡馬西平、托吡酯、苯妥英鈉、拉莫三嗪、奧卡西平等抗癲藥物長期耐藥；術(shù)前已完善腦電圖、CT、MRI等檢查。6位（4男2女，20～45歲）為正常腦外傷患者，作為對照組，篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：無抗癲藥物接觸史，無腫瘤、皮質(zhì)發(fā)育不良及血管畸形。

1.8 免疫組化 免疫組化染色采用SABC法，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水并修復(fù)抗原（PH6.0的枸櫞酸緩沖液熱修復(fù)）后用0.01M PBS漂洗5 min×3，次入0.3%過氧化氫水溶液15 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，山羊血清室溫封閉20 min，滴加稀釋的一抗，4℃溫盒內(nèi)過夜，其后步驟按試劑說明書進(jìn)行。用PBS代替一抗作陰性對照。每張切片在同一放大倍數(shù)（×400倍）、同一光強(qiáng)度下拍攝，經(jīng)灰度調(diào)節(jié)后用Image－Pro Plus6.0測量切片上陽性反應(yīng)物的平均光密度值。用平均光密度值表示陽性顆粒表達(dá)強(qiáng)度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)（除行為學(xué)數(shù)據(jù)之外）用±s表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。腦電圖表現(xiàn)及大鼠ADK、GFAP免疫組化分析采用單因素方差分析和 LSD-t檢驗(yàn)（方差齊），Dunnett’s-t檢驗(yàn)（方差不齊）；人ADK免疫組化分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；行為學(xué)數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)；P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)表現(xiàn) 匹羅卡品應(yīng)用后約30 min，大鼠開始出現(xiàn)癲持續(xù)狀態(tài)（SE），即前爪陣攣、身體僵直后肢站立、跌倒。130只接受氯化鋰－匹羅卡品腹腔注射的大鼠，95只（73.08%）出現(xiàn)SE，其中22只（23.16%）在出現(xiàn)SE后死亡，73只存活。在存活的75只大鼠中模型組的25只在視頻監(jiān)測過程中有2只死亡，18只出現(xiàn)了慢性自發(fā)性發(fā)作（SRS），潛伏期中位數(shù)為25 d，發(fā)作頻率中位數(shù)為2.0／5 d；干預(yù)組的25只大鼠有3只在視頻監(jiān)測過程中死亡，13只出現(xiàn)了SRS，潛伏期中位數(shù)為30 d，發(fā)作頻率中位數(shù)為1.02／5 d；對照組23只大鼠有3只在視頻監(jiān)測過程中死亡，17只出現(xiàn)了慢性自發(fā)性發(fā)作，潛伏期中位數(shù)為25 d，發(fā)作頻率中位數(shù)為1.99／5 d。干預(yù)組潛伏期較模型組明顯延長（P＜0.05），發(fā)作頻率明顯降低（P＜0.05）；對照組與模型組無顯著性差異（P＞0.05）（表1）。

表1 Olomoucine干預(yù)對潛伏期及發(fā)作頻率的影響

2.2 腦電圖改變 正常大鼠頭皮腦電圖波形基本節(jié)律為8～13 Hz、20～120μV的α波，間低幅β波及少量孤立的δ波。癲大鼠出現(xiàn)棘波發(fā)放（SWDs 20～27 Hz，150～210μV）。在出現(xiàn)SRS的大鼠中模型組、干預(yù)組及對照組各有13只（72.22%），8只（61.54%），和11只 （64.71%）監(jiān)測到SWDs。本實(shí)驗(yàn)采用定量腦電圖對SWDs進(jìn)行分析，模型組（321±59.593）waves／30 min，干預(yù)組（141.5±25.208）waves／30 min，對照組（338.64±62.5）waves／30 min。干預(yù)組較模型組棘波發(fā)放次數(shù)明顯減少（F＝35.856，P＝0.0001），對照組和模型組之間無顯著性差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 正常組（A）與模型組（B）腦電圖波形；Olomoucine干預(yù)后各組在慢性期的棘波發(fā)放情況（C） 干預(yù)組的棘波發(fā)放數(shù)量較模型組明顯減少（＊P＜0.05）；對照組與模型組比較無顯著性差異（P＞0.05）

2.3 Olomoucine減少了星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生及降低了ADK的表達(dá) 為了明確Olomoucine干預(yù)后是否對星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生及ADK的表達(dá)產(chǎn)生了影響，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化半定量的方式進(jìn)行分析，分析指標(biāo)為平均光密度值。對于代表星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP的表達(dá)，正常組、模型組、干預(yù)組及對照組的平均光密度值分別為0.084490±0.0116697，0.130831±0.0108002，0.084100±0.011154，0.130564±0.0094126，干預(yù)組較模型組表達(dá)明顯減少（OD meanF＝63.987，P＜0.05）。對于ADK的表達(dá)，正常組、模型組、干預(yù)組及對照組的平均光密度值分別為0.12644±0.0131760，0.173315±0.0160088，0.127338±0.0173762，0.170936±0.0235768，干預(yù)組較模型組表達(dá)明顯減少（OD meanF＝21.840，P＜0.05）（圖2、3）。

圖2 各組大鼠海馬CA3區(qū)GFAP表達(dá)情況（A代表正常組；B代表模型組；C代表干預(yù)組；D代表對照組；E為統(tǒng)計(jì)分析圖） 干預(yù)組GFAP表達(dá)較模型組明顯減少（＊P＜0.05），對照組較模型組無顯著性差異（P＞0.05）

圖3 各組大鼠海馬CA3區(qū)ADK表達(dá)情況（A代表正常組；B代表模型組；C代表干預(yù)組；D代表對照組；E為統(tǒng)計(jì)分析圖） 干預(yù)組ADK表達(dá)較模型組明顯減少（＊P＜0.05）；對照組較模型組無顯著性差異（P＞0.05）

圖4 人顳葉內(nèi)側(cè)ADK表達(dá)情況（A代表腦外傷患者；B代表癲患者；C為統(tǒng)計(jì)分析圖） 癲患者ADK的表達(dá)較腦外傷患者明顯增加（＊P＜0.05）

3 討 論

1 Meijer L.，Guidet S，Philippe M.Progress in cell research，Plenum.Press：New York，1997.3.

2 Dunphy，W.G.Methodsin enzymology：cell cycle control，Academic.Press：London，1997.283，678.

3 Meijer L.Trends in cell biology，1996，6（4）：393-397.

4 Wandl S.Wesierska-gadek J.Is olomoucine，a weak CDK2 inhibitor，able to induce apoptosis in cancer cells？Ann N Y Acad Sci，2009，1171（1）：242-249.

5 Wesierska-Gadek JM，Gueorguieva MP，Kramer，et al.A new，unexpected action of olomoucine，a CDK inhibitor，on normal human cells：up-regulation of CLIMP-63，a cytoskeleton-linking membrane protein.J Cell Biochem，2007，102（6）：1405-1419.

6 Orrin Devinsky，Annamaria Vezzani，Souhel Najjar，et al.Glia and epilepsy：excitability and inflammation.Trends in Neurosciences，Available online 5 January 2013.

7 Gerald Seifert，Christian Steinh user.Neuron-astrocyte signaling and epilepsy.Experimental Neurology，Corrected Proof，Available，2011.

8 Aronica E，Zurolo E，Iyer A，et al.Upregulation of adenosine kinase in astrocytes in experimental and human temporal lobe epilepsy.Epilepsia，2011，52（9）：1645-1655.

9 Carlos Matute，F(xiàn)abio Cavaliere.Neuroglial interactions mediated by purinergic signaling in the pathophysiology of CNS disorders.Seminars in Cell ＆ Developmental Biology，2011，22（2）：252-259.

10 Theofilas P，Brar S，Stewart KA，et al.Adenosine kinase as a target for therapeutic antisense strategies in epilepsy.Epilepsia，2011，52（3）：589-601.

11 Gouder N，Scheurer L，F(xiàn)ritschy JM，et al.Overexpression of adenosine kinase in epileptic hippocampus contributes to epileptogenesis.J Neurosci，2004，24（4）：692-701.

12 Wang W，Redecker C，Yu ZY，et al.Rat focal cerebral ischemia induced astrocyte proliferation and delayed neuronal death are attenuated by cyclin-dependent kinase inhibition.J Clin Neurosci，2008，15（2）：278-285.

13 Cernak I，Stoica B，Byrnes KR，et al.Role of the cell cycle in the pathobiology of central nervous system trauma.Cell Cycle，2005，4（5）：1286-93.

14 Di Giovanni S，Movsesyan V，Ahmed F，et al.Cell cycle inhibition provides neuroprotection and reduces glial proliferation and scar formation after traumatic brain injury.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102（5）：8333-8338.

15 Kejian W，F(xiàn)ang H，Jingling S.Use of quantitative EEG in models of whole cerebral ischemia in rats.ACTA Academine Medicine XUZHOU，2001，21（3）：779-784.

16 Wang W，Redecker C，Yu ZY，et al.Rat focal cerebral ischemia induced astrocyte proliferation and delayed neuronal death are attenuated by cyclin-dependent kinase inhibition.J Clin Neurosci，2008，15（2）：278-85.

17 Mahmood Amiria，b，c，F(xiàn)ariba Bahramid，Mahyar Janahmadie.On the role of astrocytes in epilepsy：A functional modeling approach.Neuroscience Research，2012，72（1）：172-180.

18 Du XP，Sun MZ，Yu ZY，et al.Effects of cyclin dependent protein kinase inhibitor olomoucine on the neuronal apoptosis after status epilepticus：experiment with rats.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2007，87（29）：2025-2029.

19 Cano-Abad MF，Herrera-Peco I，Sola RG，et al.New insights on culture and calcium signaling in neurons and astrocytes from epileptic patients.International Journal of Developmental Neuroscience，2011，29（2）：121-129.

20 Boeson D.Adenosine kinase，epilepsy and stroke：mechanisms and therapies.Trends Pharmacol Sci，2006，27（3）：652-658.

21 Kowaluk EA，Jarvis MF.Therapeutic potential of adenosine kinase inhibitors.Expert Opin Investig Drugs，2000，9（4）：551-564.