心肌細(xì)胞肥大中番茄紅素對(duì)自噬的作用

汪海寧 李吉林 姚懷齊 楊寶軍 徐 坦

汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東汕頭 515041

番茄紅素（lycopene，Lyc）是一種廣泛存在于紅色水果和蔬菜中的天然生物色素，屬于類胡蘿卜素一族，因最早發(fā)現(xiàn)于番茄中而得名[1]。目前國(guó)內(nèi)外大量的研究證明Lyc不僅有極強(qiáng)的抗氧化能力[2]，還具有抑制炎癥因子表達(dá)、抗癌、預(yù)防衰老等多種生物學(xué)效應(yīng)[3-4]。雖然，近年來(lái)有少量關(guān)于Lyc可以防治心血管疾病、抗缺血缺氧、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，但到目前為止，未見(jiàn)有關(guān)于其在心肌肥大方面的作用和機(jī)制的研究。因此，探索其內(nèi)在的作用機(jī)制對(duì)于尋找預(yù)防和控制高血壓等心臟肥大疾病的臨床有效治療具有重要的意義。

心肌肥大的本質(zhì)是細(xì)胞合成代謝與分解代謝的失衡，機(jī)體主宰分解代謝的途徑主要有自噬。自噬（autophagy，Atg）是廣泛存在于真核細(xì)胞中一個(gè)保守的生物學(xué)現(xiàn)象，它是通過(guò)包裹待降解物形成自噬體，然后與溶酶體結(jié)合進(jìn)行多種酶的消化及降解，參與機(jī)體受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的清除，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要方式[7]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3（tiny tubes related proteins 1 light chain 3，LC3）是自噬的特異性蛋白，分為胞質(zhì)型LC3-Ⅰ和膜型LC3-Ⅱ，后者是LC3的活性形式[8]。在既往的研究中[9]，筆者已經(jīng)證實(shí)在心肌肥大中自噬受到抑制，阻斷自噬會(huì)促進(jìn)心肌肥大的發(fā)展，而Lyc是否對(duì)心肌肥大產(chǎn)生作用，其作用是否與自噬相關(guān)尚未明確；本研究旨在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大中明確Lyc的作用，探討Lyc和自噬的關(guān)系。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SD乳鼠，清潔級(jí)，1～2日齡，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK粵2012-0017）。

1.2 主要試劑

DMEM-F12培養(yǎng)基（SH30023.01B）和胎牛血清（SV30087.01）（Hyclone）；胰蛋白酶（25200056）和Ⅰ型膠原酶 （B1067）（Gibco）；5-溴脫氧尿嘧啶核苷 BrdU（B5002），血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）（A9525）和 3-甲基腺嘌呤 3MA（M9281）（Sigma）；Lyclycopene（L9879-10MG）（Sigma-Aldrich）；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 LC3Ⅰ/Ⅱ抗體（3868s），Bclin1 抗體（3738s）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶 GADPH（2118s）（Cell Signaling Technology）；羊抗兔 IgG-HRP（SA00001-2）（PTG，proteintech group），免疫印跡發(fā)光液 （WBKLS0100）（Millipore）， 四氫呋喃（THF） （tetrahydrofuran） 和 2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）（butylated hydroxytoluene）（上海寶曼生物科技有限公司）；無(wú)核酶水（9012），逆轉(zhuǎn)錄酶（DR100A），RNA酶抑制劑+脫氧核糖核苷酸混合物（RR02MA）（Takara）。

2 方法

2.1 原代心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng)

消毒乳鼠，開(kāi)胸取心臟，用D-Hank's溶液去血污，分離心室。置入離心管，剪碎1 mm3大小，加入0.125%的胰酶 37℃消化10 min，棄上清，放入 0.05%Ⅰ型膠原酶，37℃振蕩消化2 h。用上述胰酶重復(fù)消化1～2次，每次約6 min。將細(xì)胞懸液集中放入含10%胎牛血清培養(yǎng)基，均勻接種到培養(yǎng)皿，放置于5%CO2的培養(yǎng)箱60 min以分離成纖維細(xì)胞。以1×106/mL密度接種于6孔板，加入100 U/mL鏈霉素和青霉素防止污染，及0.1 mmol/L的Brdu抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，最后放入50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。接種24 h后80%的細(xì)胞生長(zhǎng)成片并有規(guī)律搏動(dòng)時(shí)，換無(wú)血清DMEM處理24 h后分組干預(yù)。在予以Lyc處理前，先將Lyc溶解于含有 0.025%丁基羥基甲苯（BHT）的四氫呋喃。其在培養(yǎng)基中的濃度控制在0.05%（V/V），不會(huì)影響細(xì)胞活性。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組

首先在 AngⅡ（1 μmol/L）誘導(dǎo)的心肌肥大中，觀察Lyc（5 μmol/L）對(duì)細(xì)胞的作用，將心肌細(xì)胞分為四組進(jìn)行干預(yù)：對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc 組（5 μmol/L）和Lyc組（5 μmol/L）；于 48 h檢測(cè)心肌肥大的標(biāo)志物ANP的mRNA表達(dá)水平。為觀察心肌肥大時(shí)Lyc（5 μmol/L）對(duì)自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3蛋白的影響，將心肌細(xì)胞分為四組進(jìn)行干預(yù)：對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc 組（5 μmol/L）和 AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）組+3-MA（5 μmol/L）組；于 48 h 以 Western blot法測(cè)定Beclin1和LC3蛋白的水平。

2.3 細(xì)胞鏡檢

用AngⅡ和（或）Lyc干預(yù)48 h的心肌細(xì)胞以4%PFA固定，顯微鏡400倍拍照，每組取50個(gè)同樣大小視野，利用圖像分析軟件Image pro plus 6.0計(jì)算細(xì)胞面積[9]。

2.4 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)

冰上裂解細(xì)胞30 min，收取蛋白。取總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白以80 V，100 min轉(zhuǎn)至 PVDF膜上；用 50 g/L的 BSA封閉 1 h，加 LC3B抗體（1∶1000）、GADPH 抗體（1∶10 000）4℃孵育過(guò)夜；次日用TBST洗膜，與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體（1∶10 000）室溫孵育 1 h；用 ECL顯影、曝光。采用圖像分析軟件檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，LC3Ⅱ與LC3Ⅰ條帶的比值代表LC3蛋白的表達(dá)水平，其余以GAPDH作為參照[9]。

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR

常規(guī)Trizol裂解法提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照文獻(xiàn)[9]做標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量PCR體系。在Roche PCR分析儀器里擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5 min，然后 94℃ 15 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，共 30 循環(huán)，72℃ 6 min。反應(yīng)結(jié)束后，使用PCR儀配套軟件進(jìn)行分析。重復(fù)3次，數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。引物序列：ANP：上游引物5'-TGAGCCGAGACAGCAAACATC-3'，下游引物5'-AGGCCAGGAAGAGGAAGAAG C-3'；GAPDH：上游引物5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物 5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組之間的差異用One-way ANOVA比較均值的單因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Lyc在AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大中的作用

本研究從心肌細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞面積及心肌肥大標(biāo)志物水平這三個(gè)方面，明確Lyc在AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大中的作用。將心肌細(xì)胞分為四組進(jìn)行干預(yù)：對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）和 Lyc（5 μmol/L）組；結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AngⅡ刺激48 h后細(xì)胞面積增大（P＜0.01），心肌肥大標(biāo)志物ANP的mRNA水平上調(diào)（P＜0.01）；Lyc結(jié)合 AngⅡ干預(yù)，細(xì)胞大小和面積明顯減小（P＜0.05），ANP的mRNA比值顯著下降（P＜0.05）；而用 Lyc本身對(duì)心肌細(xì)胞大小和形態(tài)無(wú)明顯作用（P＞0.05），ANP的mRNA比值無(wú)顯著影響（P ＞ 0.05）（圖1、表1）。 提示 Lyc可抑制 AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

圖1 Lyc在AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大中的作用

表1 四組大鼠心肌細(xì)胞面積和ANPmRNA測(cè)定結(jié)果比較（±s，n=5）

表1 四組大鼠心肌細(xì)胞面積和ANPmRNA測(cè)定結(jié)果比較（±s，n=5）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與 AngⅡ組比較，#P＜0.05

組別 細(xì)胞面積（像素） ANP的相對(duì)含量對(duì)照組260.50±26.486.35±0.99 AngⅡ組517.19±52.31**17.83±2.07**AngⅡ+Lyc組355.82±40.45#12.16±1.41#Lyc組254.09±27.635.60±0.87 F值56.518157.048 P值 ＜0.05＜0.05

3.2 在心肌肥大中Lyc對(duì)自噬的作用

為明確在心肌肥大中Lyc對(duì)自噬的作用，將細(xì)胞分為四組：對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc 組（5 μmol/L）和 AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）組+3-MA（5 μmol/L）組；于48 h以Western blot法測(cè)定Beclin1和 LC3蛋白的水平，LC3Ⅱ/Ⅰ反應(yīng)自噬活性。結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，AngⅡ干預(yù) 48 h后 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和 Beclin1的蛋白水平下降（P＜0.05），加入 Lyc干預(yù)后 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和 Beclin1的蛋白水平有所增加 （P＜0.05），而使用 3-MA后 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和 Beclin1的蛋白水平迅速下降（P ＜ 0.01）；3-MA（5 μM）對(duì)細(xì)胞本身無(wú)影響（圖2、3，表2）。

圖2 在心肌肥大中Lyc對(duì)LC3蛋白的影響

圖3 在心肌肥大中Lyc對(duì)Beclin1蛋白的影響

4 討論

從20世紀(jì)末人們發(fā)現(xiàn)服用Lyc能明顯降低前列腺癌的發(fā)病率至今，已有大量的流行病學(xué)調(diào)查、臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明Lyc具有極強(qiáng)的抗氧化能力，可以預(yù)防各種慢性疾病[8-10]。特別是在心血管疾病中，Lyc不僅可以降低血脂，降低收縮壓，減少心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，還能緩解缺血/再灌注損傷[11-12]。但對(duì)于其是否有抑制心肌肥大的作用及相關(guān)機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次在心肌肥大的模型上探討Lyc的作用和與自噬之間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)觀察到，AngⅡ干預(yù)心肌細(xì)胞后細(xì)胞面積明顯增大、心肌肥大標(biāo)志物心房利鈉多肽（ANP）明顯上升，說(shuō)明AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大模型成功；然后加入Lyc干預(yù)發(fā)現(xiàn)，Lyc減少了AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞面積的增大，降低了ANP的升高，在一點(diǎn)程度上對(duì)心肌肥大起到了抑制作用。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大中伴有自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3蛋白表達(dá)的下降，而Lyc的干預(yù)卻促進(jìn)了自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3蛋白的表達(dá)。利用自噬阻斷劑3MA降低了Lyc對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抑制作用，提示Lyc可能通過(guò)激活自噬來(lái)抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大。

表2 四組大鼠心肌LC3和Beclin1蛋白測(cè)定結(jié)果比較（±s，n=5）

表2 四組大鼠心肌LC3和Beclin1蛋白測(cè)定結(jié)果比較（±s，n=5）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與 AngⅡ組比較，#P＜0.05；與 AngⅡ+Lyc組比較，**P＜0.01

組別 LC3蛋白相對(duì)含量 Beclin1蛋白相對(duì)含量對(duì)照組0.671±0.0520.734±0.067 AngⅡ組0.408±0.041*0.451±0.053*AngⅡ+Lyc組0.608±0.045#0.685±0.058#AngⅡ+Lyc+3-MA 組0.219±0.023**0.347±0.049**F值177.114202.873 P值 ＜0.05＜0.05

自噬在心臟中的作用存在著爭(zhēng)議。早在20世紀(jì)80年代，人們就發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加和細(xì)胞肥大的同時(shí)，伴隨著自噬水平的降低[13]。21世紀(jì)初Nakai等[14]在橫主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的早期心肌肥大模型中發(fā)現(xiàn)，自噬水平明顯低于假手術(shù)組，提示心肌肥大代償期，自噬活性顯著下降；此外亦有文獻(xiàn)報(bào)道自噬的激活劑雷帕霉素可以阻斷由主動(dòng)脈縮窄[15]、甲狀腺激素[16]引起的心肌肥大，并且逆轉(zhuǎn)已經(jīng)存在的心肌肥大[17]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3可通過(guò)上調(diào)自噬水平，使心肌肥大的心臟體積縮小[18]。目前關(guān)于Lyc對(duì)自噬的作用在心臟病中的研究是空白。筆者前期實(shí)驗(yàn)表明自噬對(duì)于AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大發(fā)展可能起抑制作用[9]。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上明確了Lyc具有抗心肌肥大和提高自噬水平的作用，而阻斷自噬會(huì)明顯降低Lyc對(duì)細(xì)胞肥大的影響，提示自噬可能是Lyc抑制心肌肥大的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，而Lyc是如何調(diào)控自噬，其具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究和探索。

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