紫杉醇對人樹突狀細胞的生物活性的影響

楊 琨 董 武 榮 陽 趙艷敏 高笑天 汪 明 張 月 劉瑞雪

1.遼寧省人民醫(yī)院中心實驗室，遼寧沈陽 110016；2.中國醫(yī)科大學遼陽中心醫(yī)院放射科，遼寧遼陽 111000；3.上?？氯R遜生物技術有限公司，上海 201201；4.遼寧省人民醫(yī)院消化二科，遼寧沈陽 110016

惡性腫瘤在我國居民疾病致死原因中位列第三，其中肺癌的致死率逐年上升。最近的研究數(shù)據(jù)顯示，肺癌已經(jīng)超過胃癌，成為所有癌癥中每年致死人數(shù)最多的腫瘤[1]。目前腫瘤主要的治療方法為外科手術切除，化療、放療。但腫瘤患者經(jīng)過手術、常規(guī)化療、放療達到臨床治愈后，體內(nèi)仍殘留腫瘤細胞，停止治療后，殘留的腫瘤細胞又開始增殖，經(jīng)若干時間后會達到109個細胞，出現(xiàn)臨床復發(fā)，這是治療失敗的主要原因之一。生物免疫治療作為新的治療方法最近得到了廣泛的關注，其具有靶向殺傷、特異性高、不良反應小以及可以殺傷對化療耐藥的腫瘤細胞等優(yōu)勢[2-3]。目前在國內(nèi)、外得到廣泛應用的免疫細胞治療是樹突狀細胞（dendritc cell，DC）和細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cells，CIK）兩種細胞聯(lián)合治療腫瘤，但傳統(tǒng)治療理念認為化療藥物可以殺死免疫細胞，所以生物免疫治療經(jīng)常在化療間歇期進行，筆者查閱了一些國外的文獻，認為只要掌握好化療藥物的劑量，在化療期間也可應用免疫細胞治療，本實驗通過體外和體內(nèi)兩種途徑，探究化療藥物紫杉醇對免疫細胞DC、CIK生物活性的影響和對抑制腫瘤能力的調控，為化療期間同時應用免疫細胞治療提供基礎理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腫瘤細胞株 肺癌A549細胞株來源于中國醫(yī)科大學腫瘤研究所，由遼寧省人民醫(yī)院生物治療中心實驗室體外傳代培養(yǎng)。

1.1.2 藥品及試劑 基因重組人IL-2（北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司）、抗-CD3單抗（CD3McAb）、淋巴細胞分離液（Ficoll Paque Plus公司）、Triton X-100（德國Applichem公司）、基因重組人IFN-γ（上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司）、白細胞介素-1（IL-1）、RPMI Medium 1640培養(yǎng)基（美國 GIBCO）、胎牛血清（美國 GIBCO）、PBS緩沖液、紫杉醇注射液、酶聯(lián)免疫檢測儀、全自動血細胞分析儀、24及96孔板、復方枸櫞酸鈉保存液、流式細胞檢測抗體 anti-CD86-FITC、anti-CD40-PE、anti-MHCⅡ-PE、anti-IL-12-PE均來自 BD公司。LDH ELISA試劑盒。

1.1.3 實驗動物 30只SPF級BALB/C裸鼠，購于北京華阜康科技股份有限公司，（許可證號：SCXK （京）2009-004），由沈陽中海生物技術開發(fā)有限公司動物中心飼養(yǎng)，雌性，鼠齡 6～8 周，體重 18～22 g。

1.2 方法

1.2.1 凍融法制備肺癌A549細胞抗原 消化收集對數(shù)生長期的A549細胞，用PBS液離心洗滌兩次，再用PBS液重懸為1×1010個/L，封裝入凍存管。置-80℃冰箱冷凍 10 min，重復 3次，然后，以 10 000 r/min離心30 min，取上清液-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DC細胞誘導、擴增 機采健康人外周血35 mL，用Ficoll密度梯度離心，分離單個核細胞。用PBS洗滌2次并計數(shù)。離心并將細胞重懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。收集非黏附性細胞于50 mL離心管中，用于誘導CIK細胞。在留有貼壁細胞的培養(yǎng)瓶中加入含有1000 U/mL rhGM-CSF和1000 U/mL rhIL-4的10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液100 mL，分5組培養(yǎng)，分別在紫杉醇 5 ng/mL（b 組）、10 ng/mL（c 組）、20 ng/mL（d 組）、40 ng/mL（e組）的濃度下及不加紫杉醇的條件下（a組）培養(yǎng)DC細胞，每3天半量換液，同時補足上述rhGM-CSF及 rhIL-4， 置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于DC培養(yǎng)第 5天加入10 μL/mL肺癌 A549細胞凍融抗原，第6天加入1000 U/mL腫瘤壞死因子，分別收集培養(yǎng)第7天的各組DC細胞，檢測各組DC細胞的存活率，并用于其他實驗。

1.2.3 各組DC細胞表型、細胞因子檢測 各組DC細胞上清培養(yǎng)液用于IL-12的流式細胞檢驗。沉淀的細胞用 FACS 緩沖溶液（HBSS，2%FBS，0.05%NaAzide）洗滌，并用含有符合流式儀器要求的anti-CD86-PE、anti-CD40-PE、anti-MHCⅡ-PE抗體的 FACS重懸浮，在4℃下培養(yǎng)30 min。用FACS緩沖溶液洗滌兩遍，用流式細胞儀分析，所得數(shù)據(jù)用FACSDiva軟件分析（美國BD公司）。

1.2.4 CIK細胞的誘導和擴增 將上述誘導DC時收集的非貼壁細胞，調整細胞密度至1×106個/mL，用于CIK 細胞培養(yǎng)。 當天加入 IFN-γ（1000 U/mL），24 h后加入 CD3 單抗 （50 ng/mL）、IL-2 （300 U/mL）、IL-1α（100 U/mL），置于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，第 3 天以后視培養(yǎng)情況補液或傳代，連續(xù)培養(yǎng)14 d，用于實驗。

1.2.5 裸鼠肺癌腫瘤模型的建立 收集對數(shù)生長期的A549人肺癌細胞，離心棄上清，將細胞濃度調整為5×107/mL，取混勻的細胞懸液接種于裸鼠右側腋下皮下，待腫瘤體積達到 500 mm3以上時，將腫瘤切成2 mm×1 mm×1 mm大小的瘤塊，接種于新購裸鼠右側腋下皮下，體內(nèi)傳3代后進行分組給藥。

1.2.6 乳酸脫氫酶釋放法（LDH）測定DC抗原傳遞能力 按文獻[14]所建立的方法進行殺傷實驗。取A549肺癌細胞株處于生長對數(shù)期的細胞，調整濃度至1×105/mL作為靶細胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。4 h后分別取紫杉醇處理 的DC（c組）和正常培養(yǎng)的DC細胞 （a組）5×105/mL與培養(yǎng)第 14天的CIK細胞1×107/mL共培養(yǎng)3 d作為效應細胞，進行殺傷實驗：分別按照效靶比5、10、20（效應細胞數(shù)量按照1×107/mL計算）將效應細胞與靶細胞混合，500 r/min離心5 min，共同孵育于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱 6 h之后，離心1500 r/min離心10 min，取上清按照試劑盒說明在用酶標儀在450 nm處測量吸光值，計算殺傷活性：殺傷活性（%）=[（實驗組 A值-總自然釋放 A值）/（最大釋放組A值-總自然釋放A值）]×100%?？傋匀会尫臕值=靶細胞自然釋放A值+效應細胞自然釋放A值。

1.2.7 動物實驗分組給藥及檢測指標 按照上述方法建立裸鼠肺癌模型，2 d后將30只裸鼠隨機分成5組，分別為A組（對照組）：細胞株A549+鹽水（NS）；B組：細胞株 A549+DC+CIK；C組：細胞株 A549+CIK+TAX；D組：細胞株A549+TAX；E組：細胞株A549+TAX+DC+CIK。各組具體用藥情況見表1。每3天檢測1次腫瘤大小，裸鼠存活時間，紫杉醇（TAX）按每只裸鼠20 mg/kg腹腔注射，CIK細胞為培養(yǎng) 14 d之后的成熟細胞，DC細胞按文中方法培養(yǎng)并激活，將各組細胞配成1×107/0.2 mL，尾部靜脈注射連續(xù) 5 d，NS為生理鹽水對照。瘤體積（V）=0.5×長徑×短徑的平方，計算每組裸鼠平均存活時間。

表1 各組用藥情況

1.3 統(tǒng)計學方法

本實驗所收集數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫杉醇對于細胞存活率的影響

在共培養(yǎng)6 d的前提下，b、c組第 6天存活率與第0天存活率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明DC細胞對于10 ng/mL以下的紫杉醇具有較好的耐受能力。濃度在10 ng/mL以上的紫杉醇會顯著降低DC細胞的存活率，d、e組第 6天存活率與第 0天存活率比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。其中與濃度40 ng/mL的紫杉醇共培養(yǎng)6 d的DC細胞，存活率僅為17.5%。見圖1。

圖1 不同濃度的紫杉醇對DC細胞生存率的影響

2.2 紫杉醇對于細胞生物活性的影響

c組和e組CD86、CD40、MHCⅡ的表達以及IL-12的分泌與正常組相比有顯著增加（P＜0.05）。d組除了CD86，其他檢測指標較正常組均有顯著統(tǒng)計學差異。b組中只有MHCⅡ較正常組有顯著的統(tǒng)計學差異。說明低濃度紫杉醇（5 ng/mL）通過上調MHCⅡ的表達增強DC細胞抗原呈遞的能力。中濃度紫杉醇（10 ng/mL） 可以上調 DC細胞上的 CD86、CD40和MHCⅡ的表達以及促進其IL-12的分泌，從而促進DC成熟并增強其抗原呈遞能力。然而在高濃度下（20、40 ng/mL）紫杉醇抑制DC細胞的免疫活性。見圖2。

2.3 LDH殺傷實驗

c組 DC+CIK細胞在效靶比 5∶1和 10∶1的情況下，殺傷效果明顯高于未經(jīng)紫杉醇處理的a組DC+CIK細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中紫杉醇處理組的細胞在效靶比為10∶1的情況下，殺傷活性已經(jīng)到達（91.37±5.24）%，與 a組 DC+CIK細胞比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 a、c組不同效靶比情況下DC+CIK細胞殺傷效果比較（%，±s）

表2 a、c組不同效靶比情況下DC+CIK細胞殺傷效果比較（%，±s）

注：與 a組比較，*P＜0.05，**P ＜0.01

組別 5∶1 10∶1 20∶1 a組34.43±1.6072.78±4.7793.54±10.02 c組43.25±1.82*91.37±5.24**94.76±9.28

2.4 動物實驗瘤體積以及存活時間

所有治療組的治療效果均明顯好于對照組（P＜0.05），E組情況明顯好于其他組（P＜0.01）。D 組在前25 d體現(xiàn)出較好的治療效果，但是25 d后瘤體增長速度增加，最終與單用細胞治療的治療組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。C組與E組差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明紫杉醇作用于DC細胞而非CIK細胞。見圖3。B、C、D、E組的平均存活時間分別為 33.0、34.0、31.8、41.8 d，明顯高于對照A組（23.8 d）（P＜0.05）。E組平均存活時間大于41.8 d，明顯高于B、C、D 組（P ＜0.01）。其中E組45d仍有 3只存活。見圖4。A組裸鼠于28 d全部死亡，B組34 d全部死亡，C組36 d全部死亡，D組36 d全部死亡，E組45d之后仍有3只存活。說明10 ng/mL以下紫杉醇能夠有效地增強DC免疫活性，從而有效扼制腫瘤的生長，延長生存時間。見圖5。

圖3 瘤體積與時間的關系

圖4 裸鼠平均生存時間

圖5 裸鼠Kaplan-Meier存活曲線

3 討論

近年來，腫瘤的綜合治療已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的單一治療，是繼手術、放療、化療之后的第四種腫瘤治療模式。生物治療因安全、有效、毒副作用低等特點，被認為是目前腫瘤綜合治療模式中最活躍、很有前途的治療手段，但傳統(tǒng)治療理念認為化療藥物具有較強的免疫抑制作用，因此很少與免疫細胞治療同時應用。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)，特定的一些化療藥物會在低濃度的情況下，促進機體免疫反應[4]。研究發(fā)現(xiàn)化療藥物有助于提高癌細胞的免疫原性[5-6]。Ding等[7]發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺與腫瘤過繼細胞治療 （adoptive cell therapy，ACT）聯(lián)用可以有效促進CD4+T細胞的分化，CD4+T細胞可特異識別腫瘤細胞。所有這些發(fā)現(xiàn)都為免疫細胞聯(lián)合化療治療腫瘤提供了理論基礎。

DC是人體內(nèi)專職的抗原提呈細胞，具有抗原提呈、激活初始T細胞、分泌免疫調節(jié)性細胞因子、分泌趨化性細胞因子、趨化T/B細胞等多種免疫調節(jié)作用。細胞因子活化的殺傷細胞（CIK細胞）共同表達CD3與CD56兩種細胞因子。其主要組成為共表達CD3和CD56的T細胞。這種T細胞具有T淋巴細胞的殺傷活性以及自然殺傷細胞的非MHC限制的優(yōu)點[7]。成熟的DC與CIK共培養(yǎng)，可以促進CIK的殺傷能力[8-10]。因此，DC細胞和CIK細胞作為免疫治療中重要的兩個部分，常聯(lián)合應用以增強免疫治療的臨床療效。

紫杉醇為廣譜化療藥物，主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤的治療。紫杉醇通過促進微管蛋白聚合來抑制有絲分裂，從而到達抑制腫瘤細胞生長的作用[11-12]。由于DC細胞極低的分裂能力，其對紫杉醇的耐受能力較強。本實驗數(shù)據(jù)顯示，在共培養(yǎng)6 d的前提下，5、10 ng/mL組第6天存活率與第0天存活率相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），存活率接近 100%，說明 DC細胞能耐受濃度在10 ng/mL以下的紫杉醇，紫杉醇濃度超過10 ng/mL對DC細胞的存活率有較大的影響，20、40 ng/mL組第6天存活率與第0天存活率相比，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。20 ng/mL的紫杉醇使DC細胞的存活率下降到45%；濃度40 ng/mL的紫杉醇共培養(yǎng)6 d的DC細胞，存活率僅為17.5%。此外，紫杉醇在中低濃度（5、10 ng/mL）下上調DC細胞表面MHCⅡ分子以及 CD40、CD86等共刺激分子表達，增強其呈遞抗原、啟動免疫應答的能力。本實驗數(shù)據(jù)顯示紫杉醇能顯著上調DC細胞對于IL-12的分泌表達，但是具體上調機制還有待探究。IL-12有促進幼稚T細胞分化為Th1細胞的作用[13]，并能激活 NK細胞和T細胞，誘生 IFN-γ、TNF-α。本研究的體外殺傷實驗中觀察到紫杉醇預處理的DC細胞與CIK細胞共培養(yǎng)，CIK細胞的殺傷能力顯著高于未處理的DC+CIK組。因為CIK細胞同時具備NK細胞和普通T細胞的特點，符合IL-12的作用特點，因此推測殺傷能力的上升可能與紫杉醇顯著上調DC細胞IL-12分泌有關。

在體內(nèi)實驗中，所有治療組腫瘤體積都明顯小于對照組（P＜0.01），但 CIK組和 DC+CIK組并無明顯的統(tǒng)計學差異。其原因有可能是CIK細胞的殺傷作用為非MHC依賴，而且DC在裸鼠體內(nèi)不能找到除了CIK細胞以外的呈遞抗原的效應細胞。單用紫杉醇治療的化療組在前25 d顯現(xiàn)出較好的治療效果，但是25 d后瘤體增長速度增加，最終與單用細胞治療的治療組無顯著的統(tǒng)計學差距。其原因可能在于紫杉醇的抑瘤原理：雖然紫杉醇能通過促進微管蛋白聚合來抑制有絲分裂，從而有效地抑制處于生長周期中分裂期的腫瘤細胞的生長，但是對于其他微管蛋白表達低下時期的腫瘤細胞并無明顯效果。然而，在紫杉醇體內(nèi)藥量衰減后，處于非分裂期的細胞進入分裂期，并大規(guī)模分裂，從而嚴重影響了紫杉醇藥物的持續(xù)效應。紫杉醇+DC+CIK治療組相對于其他治療組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。紫杉醇+DC+CIK治療組裸鼠的存活時間比其他組有明顯的統(tǒng)計學差異 （P＜0.05），其中在45 d之后仍有3只裸鼠存活。實驗結果與上文所推測的紫杉醇增強CIK殺傷力的原理相符。

綜上所述，低中濃度的紫杉醇可促進樹突狀細胞的成熟并提高其抗原呈遞能力。高濃度紫杉醇可殺死樹突狀細胞，抑制其免疫活性。中濃度紫杉醇能促進樹突狀細胞分泌IL-12。紫杉醇、DC、CIK聯(lián)合應用可提高荷瘤裸鼠生存時間。

[1]沈洪兵，俞順章.我國肺癌流行現(xiàn)狀及其預防對策[J].中國腫瘤，2004，13（5）：283-285.

[2]Rosenberg SA，Yang JC，Restifo NP.Cancer immunotherapy：moving beyond current vaccines[J].Nature Medicine，2004，10（9）：909-915.

[3]Chang CL，Hsu YT，Wu CC，et al.Dose-dense chemotherapy improves mechanisms of antitumor immune response[J].Cancer Research，2013，73（1）：119-127.

[4]Schlom J.Therapeutic cancer vaccines：current status and moving forward[J].J Natl Cancer Inst，2012，104（8）：599-613.

[5]Vander Most RG，Currie AJ，Robinson BW，et al.Decoding dangerous death：how cytotoxic chemotherapy invokes inflammation，immunity or nothing at all[J].Cell Death Differ，2008，15：13-20.

[6]Ramakrishnan R，Assudani D，Nagaraj S，et al.Chemotherapy enhances tumor cell susceptibility to CTL-mediated killing during cancer immunotherapy in mice[J].The Journal of Clinical Investigation，2010，120（4）：1111-1124.

[7]Ding ZC，Blazar BR，Mellor AL，et al.Chemotherapy rescues tumor-driven aberrant CD4+T-cell differentiation and restores an activated polyfunctional helper phenotype [J].Blood，2010，115（12）：2397-2406.

[8]Linn YC，Hui KM.Cytokine-induced killer cells：NK-like T cells with cytotolytic specificity against leukemia[J].Leukemia&Lymphoma，2003，44（9）：1457-1462.

[9]Marten A，Renoth S，Von Lilienfeld-Toal M，et al.Enhanced lytic activity of cytokine-induced killer cells against multiple myeloma cells after co-culture with idiotype-pulsed dendritic cells[J].Haematologica，2001，86（10）：1029-1037.

[10]Hart DN.Dendritic cells：unique leukocyte populations which control the primary immune response[J].Blood，1997，90（9）：3245-3287.

[11]Naill MC，Kolewe ME，Roberts SC.Paclitaxel uptake and transport in Taxus cell suspension cultures[J].Biochemical Engineering Journal，2012，63：50-56.

[12]Jordan MA，Wilson L.Microtubules as a target for anticancer drugs[J].Nature reviews Cancer，2004，4（4）：253-265.

[13]Trinchieri G，Pflanz S，Kastelein RA.The IL-12 family of heterodimeric cytokines：new players in the regulation of T cell responses[J].Immunity，2003，19（5）：641-644.

[14]韓露艷，費素娟，陳復興，等.唑來膦酸對人末梢血 γδT細胞殺傷胃癌細胞株SGC-7901作用的影響[J].世界華人消化雜志，2009，17（2）：181-185.