溫石棉及其代用纖維對(duì)鼠細(xì)胞EGFR及Survivin表達(dá)的影響

鄧麗娟 王洪州▲ 王利民 董發(fā)勤

1.四川綿陽(yáng)四〇四醫(yī)院 川北醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川綿陽(yáng) 621000；2.西南科技大學(xué)校長(zhǎng)辦公室，四川綿陽(yáng) 621000

國(guó)際上對(duì)溫石棉的生物安全性存在較大爭(zhēng)議[1-2]，一些學(xué)者認(rèn)為溫石棉的毒性和溫石棉所帶金屬離子、表面電荷、產(chǎn)地等性質(zhì)有較大關(guān)系。另一些學(xué)者認(rèn)為溫石棉的代用纖維也能夠引起慢性肺炎，并且發(fā)現(xiàn)巖棉纖維可引起基因突變。也有學(xué)者認(rèn)為溫石棉與煙溶液聯(lián)合對(duì)人胚肺細(xì)胞DNA的損傷具有協(xié)同作用[3-6]。由此可見溫石棉的代用纖維對(duì)人體可能也不安全。本研究利用免疫組化的方法檢測(cè)腫瘤基因表達(dá)，一方面擬證實(shí)其毒性，另一方面探討其致癌的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源

中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞 （Chinese hamster lung cell，V79細(xì)胞）購(gòu)買自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 材料與試劑

溫石棉、四川新康溫石棉、陜西陜南溫石棉、玻璃纖維、陶瓷纖維、硅灰石、巖棉來(lái)自四川西南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。兔抗鼠EGFR、Survivin單克隆抗體購(gòu)于武漢博士德公司。免疫組化SABC試劑盒（SA1022）購(gòu)于武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 制備實(shí)驗(yàn)組粉體及其懸液

將各實(shí)驗(yàn)原礦處理成5 μm左右長(zhǎng)，具體方法：將實(shí)驗(yàn)原礦反復(fù)碾壓、劈分、剪短后，然后再進(jìn)行細(xì)研磨，之后進(jìn)行篩選過(guò)濾；然后烘干，最后研磨成更細(xì)的粉體。電鏡圖片見圖1。用高溫殺菌消毒各種實(shí)驗(yàn)粉體，配置成 6 個(gè)不同濃度：1、2、4、6、8、10 mg/L。

圖1 溫石棉及其代用品粉體的掃描電鏡圖

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤基因EGFR及Survivin的表達(dá)

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分為7組，實(shí)驗(yàn)組包括四川新康溫石棉組（A組）、陜西陜南溫石棉組（B組）、玻璃纖維組（C組）、陶瓷纖維組（D組）、硅灰石組（E組）、巖棉組（F組），并設(shè)陰性對(duì)照組（G 組）。

1.2.2.2 干預(yù)及檢測(cè)方法 預(yù)先將處理后的蓋玻片放入6孔板里，將細(xì)胞接種到蓋玻片上，細(xì)胞量為2×105/孔。將調(diào)整好的細(xì)胞懸液1 mL，分別加入到培養(yǎng)板各孔中。然后把接種到培養(yǎng)板的細(xì)胞放入到CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將6種粉體6個(gè)不同濃度（1、2、4、6、8、10 mg/L） 的懸液分別取 1 mL 滴到各細(xì)胞培養(yǎng)孔中。將染毒的細(xì)胞放到CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。設(shè)陰性對(duì)照組，不加入上述任何粉體懸液，其他步驟同上。Survivin以及EGFR的免疫組織化學(xué)染色根據(jù)SABC法進(jìn)行，其主要步驟如下：①將染毒的細(xì)胞放到CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸盡6孔板培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，滴入丙酮處理30 min，吸盡每孔中的丙酮，蒸餾水沖洗3次。②30%的H2O21份+純甲醇50份混合，室溫浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水沖洗3次。③滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗。④每孔滴入一抗，Survivin以及EGFR稀釋度為 1∶200，37℃下孵育 60 min， 然后置 4℃冰箱過(guò)夜。⑤室溫下復(fù)溫 20 min，PBS（pH 7.2～7.6）沖洗 5 min×3次。⑥滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃ 20 min，PBS（pH 7.2～7.6） 洗 2 min×3 次。 ⑦滴加試劑 SABC，37℃20 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗 5 min×4 次。⑧新鮮配制的DAB溶液顯色5 min。⑨自來(lái)水沖洗后蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水封片。

1.2.2.3 免疫組化染色結(jié)果判斷及分析 陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞漿、細(xì)胞膜或胞核呈棕黃色。倒置顯微鏡下隨機(jī)選取 3個(gè)視野（10×40），用 Image-ProPlus專業(yè)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)其平均光密度值（OD）值，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組的免疫組化染色結(jié)果見圖2～5，OD 值測(cè)定結(jié)果見表1～2。 EGFR、Survivin 在陰性對(duì)照組未見表達(dá) （圖4、5）；Survivin的陽(yáng)性表達(dá)主要在細(xì)胞漿，細(xì)胞膜和細(xì)胞核有少量表達(dá)；EGFR的表達(dá)主要分布于V79細(xì)胞的細(xì)胞漿，在細(xì)胞核亦有少量表達(dá)。不同濃度溫石棉及其代用品粉體懸液染毒 V79細(xì)胞后，A組及 B組與其他組比較，EGFR、Survivin的表達(dá)最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A組與B組相比較，EGFR、Survivin的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；各組隨粉體濃度增加，EGFR、Survivin的表達(dá)均逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），呈現(xiàn)濃度依賴性。

圖2 EGFR在陜西陜南溫石棉組中的表達(dá)（10×20）

圖3 Survivin在四川新康溫石棉組中的表達(dá)（10×20）

表1 Survivin在各組 V79細(xì)胞中的表達(dá)（±s）

表1 Survivin在各組 V79細(xì)胞中的表達(dá)（±s）

注：“-”代表不表達(dá)

組別 1 mg/L 2 mg/L 4 mg/L 6 mg/L 8 mg/L 10 mg/L A組0.381±0.0070.413±0.0080.436±0.0090.473±0.0090.529±0.0060.593±0.009 B組0.390±0.0080.415±0.0070.439±0.0080.478±0.0060.537±0.0100.618±0.008 C組0.324±0.0090.365±0.0060.399±0.0050.428±0.0060.487±0.0080.549±0.006 D組0.288±0.0050.328±0.0060.365±0.0070.396±0.0040.445±0.0090.499±0.008 E組0.199±0.0070.269±0.0050.316±0.0060.355±0.0070.409±0.0090.458±0.008 F組0.099±0.0060.116±0.0050.158±0.0070.198±0.0060.229±0.0080.268±0.012 G組------

表2 EGFR在各組V79細(xì)胞中的表達(dá)（±s）

表2 EGFR在各組V79細(xì)胞中的表達(dá)（±s）

注：“-”代表不表達(dá)

組別 1 mg/L 2 mg/L 4 mg/L 6 mg/L 8 mg/L 10 mg/L A組0.349±0.0060.399±0.0080.438±0.0080.478±0.0080.528±0.0070.588±0.018 B組0.348±0.0080.408±0.0080.448±0.0080.485±0.0070.529±0.0170.609±0.007 C組0.318±0.0070.359±0.0060.395±0.0050.427±0.0060.479±0.0080.528±0.006 D組0.269±0.0060.305±0.0040.348±0.0050.399±0.0040.438±0.0100.489±0.006 E組0.179±0.0040.238±0.0080.287±0.0050.328±0.0070.381±0.0050.439±0.007 F組0.070±0.0040.125±0.0050.169±0.0040.205±0.0090.248±0.0080.289±0.019 G組------

圖4 EGFR在陰性對(duì)照組中呈陰性表達(dá)（10×20）

圖5 Survivin在陰性對(duì)照組中呈陰性表達(dá)（10×40）

3 討論

EGFR屬于表皮生長(zhǎng)因子家族（erbB家族），該家族包括 EGFR、C-erb-2、C-erb-3、C-erb-4。 EGFR 是原癌基因C-erb的表達(dá)產(chǎn)物，具有酪氨酸激酶活性，分子量為170 kD，由上千個(gè)氨基酸殘基組成。EGFR過(guò)度激活使其介導(dǎo)的信道環(huán)節(jié)受到影響，抑制凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成，EGFR在很多腫瘤中均有明顯的過(guò)表達(dá)，尤其在肺癌中的表達(dá)高達(dá)53.1%～69.7%[7-9]。

Survivin具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的和抑制細(xì)胞凋亡兩種功能，是眾多凋亡抑制蛋白中分子量最小的，它的表達(dá)產(chǎn)物是目前學(xué)術(shù)界認(rèn)為最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白。Survivin抗凋亡作用既通過(guò)與紡錘體纖維結(jié)合，間接抑制caspase對(duì)紡錘體的水解作用，有利于保護(hù)有絲分裂細(xì)胞器的完整性，抑制細(xì)胞凋亡；通過(guò)阻斷線粒體細(xì)胞色素c釋放，直接抑制凋亡效應(yīng)因子，使其活性消失[10-11]。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同濃度溫石棉及代用品粉體處理V79細(xì)胞可使細(xì)胞受損，從而誘導(dǎo)上皮細(xì)胞EGFR、Survivin基因表達(dá)的上調(diào)，隨著暴露濃度的增加，EGFR、Survivin的表達(dá)呈進(jìn)一步上調(diào)趨勢(shì)。由此可見，溫石棉及其代用品具有潛在致癌性，其部分機(jī)制可能為上調(diào)腫瘤基因EGFR和Survivin的表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞癌變。但是，從實(shí)驗(yàn)本身來(lái)說(shuō)，還存在兩方面的問(wèn)題：首先，樣本量并不很足，每組數(shù)據(jù)使用3次實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果取平均值。其次，溫石棉以及其代用品的如何影響EGFR、Survivin的表達(dá)、通過(guò)什么物質(zhì)進(jìn)行影響、影響通道是什么還需要進(jìn)一步考察。筆者認(rèn)為，在后期的試驗(yàn)中，應(yīng)適當(dāng)增加A組以及B組的樣本量，仔細(xì)考察溫石棉以及其代用品對(duì)于EGFR、Survivin的作用途徑。但是，總的來(lái)說(shuō)，本文為后期實(shí)驗(yàn)做出了鋪墊作用，通過(guò)本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，溫石棉及其代用纖維對(duì)于與鼠細(xì)胞EGFR及Survivin表達(dá)有顯著的增強(qiáng)作用。

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