超順磁性納米鐵標記大鼠骨髓基質干細胞的實驗研究

張 旭 鹿 蕾 張 勉 張 婧 王艷麗 王美青

第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院解剖生理學教研室，陜西西安 710032

用干細胞移植治療疾病是當今醫(yī)學研究的熱點之一[1-2]，但移植后如何從受體辨別供體細胞，并觀察其在活體內的生存遷徙情況，一直是困擾其臨床應用的瓶頸之一[3]。超順磁性納米鐵粒子（superparamagnetic iron nanoparticle，SPIO）可作為磁共振成像分子探針標記骨髓基質干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）[3]，從而能夠檢測活體內細胞的遷徙、代謝和生物學行為。本實驗以超順磁性納米鐵粒子標記大鼠BMSCs，檢測其對細胞生物學特性的影響并探討不同濃度SPIO標記大鼠BMSCs的生物學特性和生命狀態(tài)，為BMSCs的活體內示蹤研究提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以4周齡雌性SD大鼠（體重約120 g，由第四軍醫(yī)大學動物中心提供）為實驗動物，主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、復合膠原酶 NB4、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、納米鐵（由哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院醫(yī)學影像中心惠贈）、亞鐵氰化鉀、鹽酸。主要儀器：倒置相差顯微鏡、JENM1220型透射電鏡。

1.2 SD大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

取大鼠雙側脛骨及股骨，用無血清DMEM培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，將沖洗獲得的細胞懸液離心，取細胞沉淀，加入適量含10%胎牛血清的低糖型DMEM/F12培養(yǎng)基，置于5%CO2、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。多次換液傳代使BMSCs純化，取第4代細胞進行爬片，4%多聚甲醛固定后行HE染色，光鏡下觀察。取培養(yǎng)的第5代細胞，吹打為單細胞懸液接種，進行細胞爬片。磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定15 min，以封閉液（PBS含1%牛血清白蛋白，0.1%Triton）室溫下封閉30 min，加入兔抗小鼠 CD45，CD105，CD166，CD90 抗體 4°C 過夜后室溫30 min，PBS洗滌3次，每遍5 min，然后以CY3聯抗兔抗體室溫下避光孵育 1 h，DAPI室溫（1∶500）染核 5 min，PBS洗滌3次，每遍5 min，加熒光保護劑，激光共聚焦觀察 CD45、CD105、CD166、CD90 的表達。

1.3 SPIO標記BMSCs的制備與鑒定

1.3.1 SPIO-BMSCs制備

取對數生長期的BMSCs，反復吹打成單細胞懸液。以5×105/mL的密度接種到含有不同濃度SPIO的20%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基中孵育。SPIO濃度分別為15、25、50 mg/L，5%CO2、37°C 培養(yǎng) 48 h。 不含 SPIO 的 20%胎牛血清培養(yǎng)基為對照。

1.3.2 SPIO-BMSCs鑒定

1.3.2.1 普魯士藍染色 用不同濃度SPIO標記的BMSCs制備細胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，放入Pearl液（含2%亞鐵氰化鉀和6%鹽酸溶液）中常溫孵育30 min，蒸餾水洗滌，顯微鏡下觀察。以未標記細胞作對照。

1.3.2.2 透射電鏡檢查 標記后BMSCs經0.25%胰蛋白酶消化，1500 r/min離心10 min后棄上清液，向細胞沉淀中加入2.5%戊二醛液固定30 min，再用1%鋨酸固定30 min，0.5%醋酸鈾4°C染色固定過夜，梯度乙醇脫水，EP812包埋。超薄切片，醋酸鈾復染，透射電鏡觀察。

1.4 SPIO-BMSCs的生物學特性檢測

1.4.1 SPIO-BMSCs的存活

分別將15、25、50 mg/L濃度SPIO標記培養(yǎng)的第4代BMSCs單細胞懸液與臺藍染色液以9∶1的比例混勻，靜置3 min，光鏡下計數，死細胞為藍色，活細胞不著色，計數200個細胞，計算活細胞百分比。設未標記SPIO的細胞對照組。

1.4.2 SPIO-BMSCs增殖活性

用MTT法繪制生長曲線，將各濃度的SPIO標記前后的細胞懸液接種于96孔板，每孔200 μL，設5個復孔。分別于第 1、3、5、7 d 取 5 孔，加入 MTT 液，在 5%CO2、37°C培養(yǎng)4 h后取出，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清，每孔加入150 μL DMSO。振蕩10 min，用酶標儀在490 nm處側出吸光度A值。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行處理。計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間均數比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞生長情況

原代細胞48 h半換液，見大量懸浮細胞，在瓶底可見單個細胞貼壁生長，多為短多角形。個別細胞偽足伸長，4 d全量換液，PBS漂洗，去除大量漂浮的細胞，可見分散的BMSCs成簇生長為集落狀，細胞逐漸轉變?yōu)殚L梭形，紡錘狀，胞核為圓形或橢圓形，胞漿內可見較多的顆粒（圖1a）。10 d左右細胞大部分融合，達90%以上，細胞形態(tài)均勻，長梭形，排列緊密，呈旋渦狀，有一定的方向性。傳代后，細胞形態(tài)類似纖維狀，排列更加整齊（圖1b）。

2.2 BMSCs的免疫熒光鑒定

BMSCs經免疫熒光染色，絕大多數細胞呈CD105、CD166、CD90（間質干細胞特征性標志物）陽性，CD45呈陰性。見圖2。

2.3 SPIO-BMSCs標記鑒定

2.3.1 普魯士藍鐵染色

普魯士藍染色見細胞染色陽性率＞99%，表現為細胞內有大量藍染顆粒，部分聚集成團，顆粒分布以核周和靠近細胞膜處較為明顯（圖3）。

2.3.2 透射電鏡檢查

透射電鏡觀察標記的細胞胞質內見高電子密度顆粒聚集，主要位于各級溶酶體內（圖4）。

2.4 SPIO-BMSCs活性

2.4.1 臺藍染色SPIO-BMSCs活細胞計數

實驗組1的SPIO濃度為15 mg/L時，活細胞比率與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05），但在實驗組2和實驗組3，當SPIO濃度為25、50 mg/L時活細胞比率有所降低（P ＜ 0.05）。 見表1。

2.4.2 細胞增殖活性檢測

MTT結果顯示，SPIO的濃度為15 mg/L時對細胞增殖無明顯影響（P＞0.05），而當SPIO的濃度為25、50 mg/L時，細胞增殖受到明顯抑制（P＜0.05）。見圖4。

表1 實驗組與對照組的活細胞比率結果（%，±s）

表1 實驗組與對照組的活細胞比率結果（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d實驗組1實驗組2實驗組3對照組98.12±0.21 95.76±0.36*92.11±0.21*97.98±0.24 97.86±0.21 94.49±0.56*93.12±0.31*98.11±0.21 97.43±0.28 93.12±0.19*91.12±0.67*96.98±0.65 96.82±0.19 94.89±0.76 92.43±0.37*95.67±0.34 98.21±0.67 93.43±0.46*90.98±0.43*96.94±0.54 97.12±0.31 94.29±0.19*91.01±0.54*97.32±0.34

3 討論

骨髓間充質干細胞在體外特定的誘導條件下或體內特定環(huán)境下可分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、骨髓基質、肌腱及韌帶等組織[4]。BMSCs具有定向遷移至損傷部位進行增值、分化、并修復損傷組織的能力[5-7]。骨髓間充質干細胞取材容易，對機體損傷小，且體外培養(yǎng)簡單，細胞擴增速度快，由于自體移植無明顯的免疫排斥反應，也不涉及倫理道德問題，具有良好的臨床應用前景，目前在組織工程、基因工程等研究中成為理想的種子細胞，在臨床疾病的治療過程中，對白血病、神經損傷、癌癥的治療具有很高的醫(yī)療價值。

應用外源性BMSCs治療后如何明確其療效是目前尚需解決的關鍵難題之一，SPIO是近年國外開始推廣應用的一種標記細胞的對比劑，它利用干細胞吞噬能力，通過簡單的體外培養(yǎng)，干細胞就會吞噬目該顆粒，對細胞進行活體的示蹤研究，取得了很理想的成果[8]。本實驗所用的SPIO是由Fe3O4和Fe2O3組成，是一種不需要轉染劑的SPIO。由于化學結構的特殊，即使在較弱的外磁場中也可以產生巨大的磁性，而外磁場撤銷后磁性也迅速消失，即所謂超順磁性[9]。成為目前最常用的MRI監(jiān)測的負性對比劑，應用于多種細胞的標記，以及標記后體內移植的活體示蹤研究。但是對于細胞的毒副作用主要來自于細胞體內鐵的含量，如何確定Fe濃度的安全有效范圍成為我們研究的重點，一般文獻中常用的SPIO標記細胞的濃度，通常在10～50mg/L。但是有研究指出20 mg/L鐵已經達到了標記干細胞所需要濃度的最高限，在此濃度閾值孵育過夜，細胞標記率超過97%。然而Fe的濃度達到50 mg/L，細胞的生物學特性、增殖能力、遷移能力就會受到不同程度的抑制。Ben等[10]研究發(fā)現，細胞內過多的游離的鐵能使細胞的氧化作用加強，產生過多的氧化產物和羥基自由基，細胞容易受到損傷，增殖活性降低，甚至細胞出現壞死的現象。這與本實驗濃度25 mg/L組的臺盼藍活細胞計數及MTT比對照組明顯降低，這與高濃度Fe抑制干細胞的增殖，活性降低互相吻合。本實驗的初步結果顯示濃度為15 mg/L的SPIO標記后的BMSCs生長狀態(tài)與對照組無差異，能夠保持原有的細胞狀態(tài)，形態(tài)均勻，呈長狀，排列緊密，傳代融合時間與對照組一致，臺盼藍活細胞計數實驗及MTT細胞增殖檢測都證明了標記后的細胞仍具有良好的生物學活性和正常的增殖能力。I ttrich等[11]研究結果也證實低濃度的Fe不會對細胞生命產生影響。因此，SPIO濃度為15 mg/L可安全高效標記BMSCs，為活體示蹤提供較好的技術方法，可用于對BMSCs在體內遷移、分化相關研究的示蹤。

[1]Stamm C，Westphal B，Kleine HD，et al.Autologous bone marrow stem cell transplantation for myocardial regeneration [J].Lancet，2003，361（9351）：45-46.

[2]陳長青，陳晨，鄧永文，等.大鼠脂肪干細胞磁性標-～57L MRI研究[J].中華醫(yī)學雜志，2008，7：1671-2897.

[3]Chen Changqing，Chen Chen，Deng Yongen，et al.Magnetic labeling and MR imaging of rat adipose tissue-derived stromal cells[J].Chinese Journal of Neurosurgical Disease Research，2008，7：1671-2897.

[4]Silva GV，Litovsky S，Assad JA，et al.Mesenchymal stem cells differentiate into an endothelial phenotype，enhance vascular density，and improve heart function in a canine chronic ischemia model[J].Circulation，2005，111（2）：150-156.

[5]Shabbir A，Zisa D，Suzuki G，et al.Heart failure therapy mediated by the trophie activities of bone marrow mesenchymal stem cells：a noninvasive them peutic regimen [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296（6）：1888-l897.

[6]Baker AH，Sica V，Work LM，et al.Brain protection using autologous bone marrow cell，metalloproteinase inhibitors，and metabolic treatment in cerebral ischemia [J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（9）：3597-3602.

[7]Matsubara T，Suardita K，Ishii M，et al.Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine：differences between alveolar and lilac bone marrow stromal cells [J].J Bone Miler Res，2005，20（3）：399-409.

[8]Dunning MD，Lakatos A，Loiz L，et al.Superparamagnetic iron oxtionlabeled Schwann cells and olfactory ensheathing cells can be traced in vivo by magnetic resonance imaging and retain functional properties after transplantation into the CNS[J].J Neurosci，2004，24：9799.

[9]劉祖黎，杜玉卿，胡道予，等.超小型超順磁性氧化鐵磁共振對比劑的制備及性能研究[J].功能材料，2005，36：350.

[10]Ben HT，van Heeswijk RB，Einstein O，et al.Serial in vivo MR tracking of magnetically labeled neural spheres transplanted in chronic EAE mice[J].Magn Reson Med，2007，57（1）：164-171.

[11]Ittrich H，Lange C，Togel F，et al.In vivo magnetic resonance imaging of iron oxide-Labeled，arteriallyinjected mesenchmal stem cells in kidneys of rats with acute ischemic kidney injury：detection and monitoringat3T[J].JMagneticResonImaging，2007，25（6）：1179-1191.