棕色脂肪干細(xì)胞與白色脂肪干細(xì)胞移植對(duì)心肌梗死大鼠心功能的影響

石金鑫 劉劍鋒 王海濱 朱 平▲

1.解放軍總醫(yī)院南樓心一科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所前沿交叉學(xué)科研究室，北京 100850

急性心肌梗死可在短時(shí)間內(nèi)引起心肌細(xì)胞的大量死亡，心肌細(xì)胞的損傷嚴(yán)重程度取決于幾個(gè)因素：初始梗死的大小、持續(xù)時(shí)間及是否有效微血管再灌注[1]。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，干細(xì)胞治療能夠提高心臟功能，促進(jìn)心肌再生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為最常用的種子細(xì)胞之一，因其心肌分化效率很低，治療心肌梗死修復(fù)主要通過旁分泌機(jī)制而非心肌再生，而使心臟修復(fù)得不到長期改善[2]。因此，心肌再生能力對(duì)于心肌梗死后修復(fù)至關(guān)重要。

脂肪來源干細(xì)胞，因其具有取材方便、易于擴(kuò)增及免疫原性弱等優(yōu)勢(shì)，已成為目前研究的熱點(diǎn)[3]。脂肪組織分為白色脂肪和棕色脂肪。白色脂肪干細(xì)胞（white adiposederived mesenchymal stem cells，ADSCs）作為常用種子細(xì)胞之一，能夠促進(jìn)心肌梗死區(qū)新血管生成，提高受損心肌周圍微血管再灌注，防止梗死后心肌細(xì)胞大量死亡[4]。棕色脂肪來源干細(xì)胞（brown adipose-derived mesenchymal stem cells，BADSCs）作為一種新來源的種子細(xì)胞，逐漸引起關(guān)注。有研究報(bào)道，從棕色脂肪中分離的干細(xì)胞具有較高的成心肌分化能力，且可在體外自發(fā)的分化為有功能的心肌細(xì)胞[5]。在筆者既往研究中發(fā)現(xiàn)，通過組合消化酶法能夠高效的從幼年SD大鼠肩胛骨下脂肪中分離出BADSCs，并且能夠在體外使其分化為功能性心肌細(xì)胞[6]。然而，BADSCs能否在心肌梗死大鼠中有效分化為心肌細(xì)胞，且是否比ADSCs更具優(yōu)勢(shì)，目前尚未明確。本研究擬開展兩種不同脂肪來源干細(xì)胞移植治療大鼠心肌梗死的研究，旨在比較其改善心臟功能的效果，并探討兩者在梗死組織中促血管化作用及向心肌分化能力的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究采用隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。雄性SD大鼠[（80±20）g]用于體外分離脂肪組織，雄性 SD 大鼠（250 g左右）用于構(gòu)建心肌梗死模型。所有動(dòng)物均由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑及抗體 CD29、CD45、CD90（Biolegend），CD31、cTnT、vWAg（Sigma），Dispase Ⅱ（Roche，Germany），Ⅳ型 膠原酶（Sigma，USA，JF0710），α-MEM（Gibco，USA，1342877），胎牛血清（FBS）（MDgenics InC，USA，062010），胰酶（Gibco，USA）

1.2 方法

1.2.1 BADSCs及ADSCs的分離培養(yǎng)及分選鑒定 取80 g左右雄性SD大鼠，無菌條件下分別在肩胛骨下和腹股溝處取出脂肪組織，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍；剪碎后分別加入0.05%胰酶+0.1%Ⅳ型膠原酶+0.1%DispaseⅡ混合消化，37℃攪拌45 min，使用含10%的血清培養(yǎng)基終止消化，并通過200目的濾網(wǎng)過濾，紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，終止消化后，600 g離心5 min，分別重懸接種，隔天換液。流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，BADSCs使用細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90、CD45鑒定，ADSCs使用CD29、CD31鑒定（以上抗體均按廠家說明加入）。

1.2.2 BADSCs成心肌分化能力鑒定 BADSCs以2.5×104/cm2的細(xì)胞密度接種，分化2周后進(jìn)行免疫組化檢測。免疫組織化學(xué)檢測采用兩步法試劑盒，使用工作濃度的一抗cT-nT（1∶200 ），以 PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，DAB 顯色，顯微鏡下觀察。

1.2.3 ADSCs多向分化潛能鑒定 P3代ADSCs長至75%匯合后，加入成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)。對(duì)照組培養(yǎng)基即為ADSCs生長培養(yǎng)基。成脂誘導(dǎo)液是培養(yǎng)基中添加0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L 地塞米松，10 μmol/L 胰島素，200 μmol/L吲哚美辛；成骨誘導(dǎo)液是培養(yǎng)基中添加地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉。成脂、成骨分化分別以油紅O和茜素紅染色進(jìn)行鑒定。

1.2.4 移植細(xì)胞標(biāo)記 移植前1天BADSCs、ADSCs密度達(dá)到60%～70%時(shí)進(jìn)行慢病毒載體轉(zhuǎn)染，具體方法參見文獻(xiàn)[7]。熒光顯微鏡下觀察單體紅色熒光蛋白（RFP）的表達(dá)，大約90%以上細(xì)胞可表達(dá)mRFP。

1.2.5 大鼠心肌梗死模型制備及細(xì)胞移植 大鼠急性心肌梗死模型的制備采取冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法。結(jié)扎成功后，將心肌梗死大鼠隨機(jī)分為 3 組：PBS 對(duì)照組（n=10，100 μL）、ADSCs 移植組（n=10，100 μL）、BADSCs 移植組（n=10，100 μL）。在梗死區(qū)的周邊選擇3個(gè)注射位點(diǎn)（梗死區(qū)兩側(cè)與心尖部位）將各組細(xì)胞直接注入，采用28-gauge注射針頭。

1.2.6 心功能檢測 術(shù)后4周進(jìn)行心臟超聲檢測心臟功能，由二維圖像引導(dǎo)取M型曲線并進(jìn)行測量，測量左心室收縮末期直徑（LVESD）、舒張末期直徑（LVEDD）。 左心室短軸縮短指數(shù)（FS）=[（LVEDD-LVESD）/LVESD]×100%；左心室射血分?jǐn)?shù)（EF）=[（LVEDD3-LVESD3）/LVESD3]×100%。

1.2.7 組織學(xué)檢測 心功能檢測后處死動(dòng)物，取心肌組織，4%多聚甲醛固定，制成石蠟切片，行馬松三色（MASSON）染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色。免疫熒光染色使用工作濃度的一抗cTnT（1∶200），免疫組織化學(xué)染色使用工作濃度的一抗vWF（1∶200），對(duì)照組PBS替代一抗。微血管密度計(jì)數(shù)：vWAg染色陽性，位于心肌梗死部位，管腔可視并且血管直徑在20～100 μm的微血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。每個(gè)標(biāo)本取5張切片，每張切片取5個(gè)高倍視野。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 棕色脂肪干細(xì)胞特征及表面標(biāo)記

BADSCs分離后進(jìn)行流式細(xì)胞儀測定，結(jié)果顯示細(xì)胞表達(dá)CD90陽性，造血系標(biāo)記CD45陰性。大約培養(yǎng)2周后，顯微鏡下可觀察到形態(tài)拉長、呈肌細(xì)胞搏動(dòng)形態(tài)的細(xì)胞，并呈現(xiàn)自發(fā)的有力的搏動(dòng)。進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)這種肌細(xì)胞樣的搏動(dòng)細(xì)胞表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物cTnT（圖1、2）。

2.2 白色脂肪干細(xì)胞特征及表面標(biāo)記

ADSCs貼壁后類似成纖維樣細(xì)胞，呈梭形生長。P3代ADSCs進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞表達(dá)CD29陽性，CD31陰性。ADSCs加入成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)2周后進(jìn)行油紅O染色，顯微鏡下可見大量紅色脂滴；成骨分化4周進(jìn)行茜素紅染色可觀察到陽性的鈣化結(jié)節(jié)，這些表明ADSCs具有多向分化潛能（圖1、2）。

2.3 心功能檢查結(jié)果

超聲心動(dòng)圖檢測結(jié)果顯示，ADSCs移植組以及BADSCs移植組均可以改善梗死心肌的心功能，與PBS對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ADSCs移植組和BADSCs移植組相比，兩者心功能指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。 見圖3。

2.4 組織學(xué)檢查結(jié)果

2.4.1 心肌梗死區(qū)域膠原沉積檢測 MASSON染色進(jìn)行心肌梗死區(qū)膠原沉積檢測，PBS對(duì)照組為（63.4±4.6）%，ADSCs移植組為（48.7±4.1）%，BADSCs移植組為（46.1±3.4）%。由此可說明，ADSCs移植組和BADSCs移植組均能顯著減弱心肌梗死區(qū)纖維化程度，與PBS對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

2.4.2 新生微血管檢測 在抗 vWAg免疫組化染色的切片上計(jì)數(shù)心肌梗死區(qū)微血管密度結(jié)果顯示，PBS對(duì)照組為（98.6±9.4）/mm2，ADSCs 移植組為（239.6±17.9）/mm2，BADSCs移植組為（215.4±16.7）/mm2。 與 PBS 對(duì)照組血管密度比較，ADSCs移植組及BADSCs移植組心肌梗死區(qū)微血管密度均顯著增加（P＜0.05），其中，ADSCs移植組心肌梗死區(qū)微血管密度高于BADSCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

2.4.3 移植細(xì)胞在心肌梗死環(huán)境下的分化 細(xì)胞移植4周后，ADSCs移植組與BADSCs移植組均能在心肌梗死周邊區(qū)域觀察到共表達(dá)cTnT蛋白和mRFP蛋白的細(xì)胞，即同時(shí)表達(dá)綠色熒光與紅色熒光的細(xì)胞。BADSCs移植組更多見紅色與綠色熒光共表達(dá)的細(xì)胞，這說明BADSCs移植組在心肌梗死環(huán)境中的心肌分化程度明顯高于ADSCs移植組。BADSCs能否向血管譜系細(xì)胞分化有待進(jìn)一步研究。見圖6。

3 討論

心臟自身具有有限的再生能力。心肌梗死后，損傷的心肌細(xì)胞被巨噬細(xì)胞大量清除并被瘢痕組織取代，這些瘢痕組織由收縮能力較差的存活細(xì)胞包繞，從而引起心力衰竭甚至死亡。研究表明，移植的不同類型干細(xì)胞可以通過旁分泌途徑來修復(fù)受損心臟，然而，干細(xì)胞的旁分泌作用并不會(huì)實(shí)現(xiàn)真正的心臟再生[8]。干細(xì)胞是否可以在體內(nèi)有效地轉(zhuǎn)化為功能性的心血管譜系細(xì)胞值得重視。BADSCs是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的種子細(xì)胞來源。2004年P(guān)lanat-Bénard等[9]首次從小鼠腹股溝及肩胛骨下脂肪中分離出的細(xì)胞能夠自發(fā)的分化為有功能的心肌細(xì)胞，隨后，Yamada等[10]的研究證實(shí)，這種具有較高成心肌分化潛能的細(xì)胞主要存在于棕色脂肪組織，從棕色脂肪中分離的CD133陽性和CD29陽性干細(xì)胞具有高度自發(fā)分化心肌細(xì)胞的能力。為了進(jìn)一步證實(shí)BADSCs是否在體內(nèi)移植后仍具有較強(qiáng)的心肌分化能力及心肌梗死修復(fù)潛能，本研究開展了兩種脂肪來源干細(xì)胞心肌梗死移植及其修復(fù)效果的比較研究。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，ADSCs移植入病損組織會(huì)分泌細(xì)胞因子和生長因子，以旁分泌的方式刺激心肌修復(fù)[11]。本研究亦證實(shí)，ADSCs能夠通過其促血管化作用來提高心肌梗死的修復(fù)效果。雖然BADSCs的促血管化作用不如ADSCs，但BADSCs移植后的心功能改善作用與ADSCs無明顯差異。鑒于BADSCs具有高度的心肌分化潛能，本研究比較了其與ADSCs在體內(nèi)的心肌分化能力，結(jié)果表明，BADSCs體內(nèi)移植后仍可以分化為心肌細(xì)胞，且相較于ADSCs在心肌梗死環(huán)境下有更強(qiáng)的心肌再生能力。然而，BADSCs來源的心肌細(xì)胞是否能與宿主心肌在功能上偶聯(lián)，尚有待進(jìn)一步研究。除此之外，BADSCs也可以通過旁分泌作用促進(jìn)梗死心肌的修復(fù)。Liu等[6]證實(shí)，BADSCs可分泌多種細(xì)胞因子，如促血管生成因子VEGF、抗凋亡因子HGF、抗纖維化因子bFGF等，參與促進(jìn)血管新生、減少心肌細(xì)胞凋亡、抗心肌纖維化、減輕炎癥反應(yīng)等修復(fù)過程。本研究也證實(shí)，BADSCs具有一定的促血管化作用。盡管如此，目前，棕色脂肪在成人體內(nèi)數(shù)量很少，然而隨著人們對(duì)干細(xì)胞基礎(chǔ)生物學(xué)研究的不斷深入，有研究發(fā)現(xiàn)，棕色脂肪與白色脂肪在一定條件下能夠互相轉(zhuǎn)換，從而有望解決棕色脂肪干細(xì)胞的來源問題[11]。

本研究證實(shí)，BADSCs相較于ADSCs具有如下優(yōu)勢(shì)：①高度的成心肌分化能力，可作為優(yōu)良的心肌再生種子細(xì)胞。②與ADSCs有相似的旁分泌潛能。本研究為BADSCs用于心肌梗死移植治療提供了新的數(shù)據(jù)。

[1]Clement C，Keith M，Channon，et al.Angiogenesis in the infarcted myocardium[J].Antioxid Redox Signal，2013，18（9）：1100-1113.

[2]Gnecchi M，Danieli P.Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells express cardiomyogenic proteins but do not exhibit functional cardiomyogenic differentiation potential[J].Stem Cells Dev，2012，21（13）：2457-2470.

[3]Zhu Y，Liu T，Song K，et al.Adipose-derived stem cell：a better stem cell than BMSC [J].Cell Biochemistry and Function，2008，26（6）：664-675.

[4]Pinheiro CH，De Queiroz JC.Local injections of adipose-derived mesenchymal stem cells modulate inflammation and increase angiogenesis ameliorating the dystrophic phenotype in dystrophin-deficient skeletal muscle[J].Stem Cell Rev，2012，8（2）：363-374.

[5]Yoshihiro Y，Wang XD.Cardiac progenitor cells in brown adipose tissue repaired damaged myocardium [J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，342（2）：662-670.

[6]Liu ZQ，Wang HB.Efficient isolation of cardiac stem cells from brown adipose [J].Journal of Biomedicine and Biotechnology，2010，2010： 104296.

[7]Liu ZQ，Wang HB.The influence of chitosan hydrogel on stem cell engraftment，survival and homing in the ischemic myocardial microenviroment[J].Biomaterials，2012，33（11）：3093-3106.

[8]Segers VF，Lee RT.Stem-cell therapy for cardiac disease[J].Nature，2008，451（7181）：937-942.

[9]Planat-Bénard CV，Menard.Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells[J].Circ Res，2004，94（2）：223-229.

[10]Yamada Y，Yokoyama S.Cardiac stem cells in brown adipose tissue express CD133 and induce bone marrow nonhematopoietic cells to differentiate into cardiomyocytes[J].Stem Cells，2007，25（5）：1326-1333.

[11]Jeffrey M，Gimble，Adam J，et al.Adipose-derived stem cells for regenerative medicine[J].Circulation Research，2007，100（9）：1249-1260.