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    棕色脂肪干細(xì)胞與白色脂肪干細(xì)胞移植對(duì)心肌梗死大鼠心功能的影響

    2013-10-17 05:27:42石金鑫劉劍鋒王海濱

    石金鑫 劉劍鋒 王海濱 朱 平▲

    1.解放軍總醫(yī)院南樓心一科,北京 100853;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所前沿交叉學(xué)科研究室,北京 100850

    急性心肌梗死可在短時(shí)間內(nèi)引起心肌細(xì)胞的大量死亡,心肌細(xì)胞的損傷嚴(yán)重程度取決于幾個(gè)因素:初始梗死的大小、持續(xù)時(shí)間及是否有效微血管再灌注[1]。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明,干細(xì)胞治療能夠提高心臟功能,促進(jìn)心肌再生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為最常用的種子細(xì)胞之一,因其心肌分化效率很低,治療心肌梗死修復(fù)主要通過旁分泌機(jī)制而非心肌再生,而使心臟修復(fù)得不到長(zhǎng)期改善[2]。因此,心肌再生能力對(duì)于心肌梗死后修復(fù)至關(guān)重要。

    脂肪來源干細(xì)胞,因其具有取材方便、易于擴(kuò)增及免疫原性弱等優(yōu)勢(shì),已成為目前研究的熱點(diǎn)[3]。脂肪組織分為白色脂肪和棕色脂肪。白色脂肪干細(xì)胞(white adiposederived mesenchymal stem cells,ADSCs)作為常用種子細(xì)胞之一,能夠促進(jìn)心肌梗死區(qū)新血管生成,提高受損心肌周圍微血管再灌注,防止梗死后心肌細(xì)胞大量死亡[4]。棕色脂肪來源干細(xì)胞(brown adipose-derived mesenchymal stem cells,BADSCs)作為一種新來源的種子細(xì)胞,逐漸引起關(guān)注。有研究報(bào)道,從棕色脂肪中分離的干細(xì)胞具有較高的成心肌分化能力,且可在體外自發(fā)的分化為有功能的心肌細(xì)胞[5]。在筆者既往研究中發(fā)現(xiàn),通過組合消化酶法能夠高效的從幼年SD大鼠肩胛骨下脂肪中分離出BADSCs,并且能夠在體外使其分化為功能性心肌細(xì)胞[6]。然而,BADSCs能否在心肌梗死大鼠中有效分化為心肌細(xì)胞,且是否比ADSCs更具優(yōu)勢(shì),目前尚未明確。本研究擬開展兩種不同脂肪來源干細(xì)胞移植治療大鼠心肌梗死的研究,旨在比較其改善心臟功能的效果,并探討兩者在梗死組織中促血管化作用及向心肌分化能力的差異。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究采用隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。雄性SD大鼠[(80±20)g]用于體外分離脂肪組織,雄性 SD 大鼠(250 g左右)用于構(gòu)建心肌梗死模型。所有動(dòng)物均由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

    1.1.2 試劑及抗體 CD29、CD45、CD90(Biolegend),CD31、cTnT、vWAg(Sigma),Dispase Ⅱ(Roche,Germany),Ⅳ型 膠原酶(Sigma,USA,JF0710),α-MEM(Gibco,USA,1342877),胎牛血清(FBS)(MDgenics InC,USA,062010),胰酶(Gibco,USA)

    1.2 方法

    1.2.1 BADSCs及ADSCs的分離培養(yǎng)及分選鑒定 取80 g左右雄性SD大鼠,無菌條件下分別在肩胛骨下和腹股溝處取出脂肪組織,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍;剪碎后分別加入0.05%胰酶+0.1%Ⅳ型膠原酶+0.1%DispaseⅡ混合消化,37℃攪拌45 min,使用含10%的血清培養(yǎng)基終止消化,并通過200目的濾網(wǎng)過濾,紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞,終止消化后,600 g離心5 min,分別重懸接種,隔天換液。流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選,BADSCs使用細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90、CD45鑒定,ADSCs使用CD29、CD31鑒定(以上抗體均按廠家說明加入)。

    1.2.2 BADSCs成心肌分化能力鑒定 BADSCs以2.5×104/cm2的細(xì)胞密度接種,分化2周后進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用兩步法試劑盒,使用工作濃度的一抗cT-nT(1∶200 ),以 PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照,DAB 顯色,顯微鏡下觀察。

    1.2.3 ADSCs多向分化潛能鑒定 P3代ADSCs長(zhǎng)至75%匯合后,加入成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)。對(duì)照組培養(yǎng)基即為ADSCs生長(zhǎng)培養(yǎng)基。成脂誘導(dǎo)液是培養(yǎng)基中添加0.5 mmol/L IBMX,1 μmol/L 地塞米松,10 μmol/L 胰島素,200 μmol/L吲哚美辛;成骨誘導(dǎo)液是培養(yǎng)基中添加地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉。成脂、成骨分化分別以油紅O和茜素紅染色進(jìn)行鑒定。

    1.2.4 移植細(xì)胞標(biāo)記 移植前1天BADSCs、ADSCs密度達(dá)到60%~70%時(shí)進(jìn)行慢病毒載體轉(zhuǎn)染,具體方法參見文獻(xiàn)[7]。熒光顯微鏡下觀察單體紅色熒光蛋白(RFP)的表達(dá),大約90%以上細(xì)胞可表達(dá)mRFP。

    1.2.5 大鼠心肌梗死模型制備及細(xì)胞移植 大鼠急性心肌梗死模型的制備采取冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法。結(jié)扎成功后,將心肌梗死大鼠隨機(jī)分為 3 組:PBS 對(duì)照組(n=10,100 μL)、ADSCs 移植組(n=10,100 μL)、BADSCs 移植組(n=10,100 μL)。在梗死區(qū)的周邊選擇3個(gè)注射位點(diǎn)(梗死區(qū)兩側(cè)與心尖部位)將各組細(xì)胞直接注入,采用28-gauge注射針頭。

    1.2.6 心功能檢測(cè) 術(shù)后4周進(jìn)行心臟超聲檢測(cè)心臟功能,由二維圖像引導(dǎo)取M型曲線并進(jìn)行測(cè)量,測(cè)量左心室收縮末期直徑(LVESD)、舒張末期直徑(LVEDD)。 左心室短軸縮短指數(shù)(FS)=[(LVEDD-LVESD)/LVESD]×100%;左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)=[(LVEDD3-LVESD3)/LVESD3]×100%。

    1.2.7 組織學(xué)檢測(cè) 心功能檢測(cè)后處死動(dòng)物,取心肌組織,4%多聚甲醛固定,制成石蠟切片,行馬松三色(MASSON)染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色。免疫熒光染色使用工作濃度的一抗cTnT(1∶200),免疫組織化學(xué)染色使用工作濃度的一抗vWF(1∶200),對(duì)照組PBS替代一抗。微血管密度計(jì)數(shù):vWAg染色陽(yáng)性,位于心肌梗死部位,管腔可視并且血管直徑在20~100 μm的微血管進(jìn)行計(jì)數(shù),取平均值。每個(gè)標(biāo)本取5張切片,每張切片取5個(gè)高倍視野。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 棕色脂肪干細(xì)胞特征及表面標(biāo)記

    BADSCs分離后進(jìn)行流式細(xì)胞儀測(cè)定,結(jié)果顯示細(xì)胞表達(dá)CD90陽(yáng)性,造血系標(biāo)記CD45陰性。大約培養(yǎng)2周后,顯微鏡下可觀察到形態(tài)拉長(zhǎng)、呈肌細(xì)胞搏動(dòng)形態(tài)的細(xì)胞,并呈現(xiàn)自發(fā)的有力的搏動(dòng)。進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光學(xué)鑒定,發(fā)現(xiàn)這種肌細(xì)胞樣的搏動(dòng)細(xì)胞表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物cTnT(圖1、2)。

    2.2 白色脂肪干細(xì)胞特征及表面標(biāo)記

    ADSCs貼壁后類似成纖維樣細(xì)胞,呈梭形生長(zhǎng)。P3代ADSCs進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞表達(dá)CD29陽(yáng)性,CD31陰性。ADSCs加入成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)2周后進(jìn)行油紅O染色,顯微鏡下可見大量紅色脂滴;成骨分化4周進(jìn)行茜素紅染色可觀察到陽(yáng)性的鈣化結(jié)節(jié),這些表明ADSCs具有多向分化潛能(圖1、2)。

    2.3 心功能檢查結(jié)果

    超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果顯示,ADSCs移植組以及BADSCs移植組均可以改善梗死心肌的心功能,與PBS對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ADSCs移植組和BADSCs移植組相比,兩者心功能指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。 見圖3。

    2.4 組織學(xué)檢查結(jié)果

    2.4.1 心肌梗死區(qū)域膠原沉積檢測(cè) MASSON染色進(jìn)行心肌梗死區(qū)膠原沉積檢測(cè),PBS對(duì)照組為(63.4±4.6)%,ADSCs移植組為(48.7±4.1)%,BADSCs移植組為(46.1±3.4)%。由此可說明,ADSCs移植組和BADSCs移植組均能顯著減弱心肌梗死區(qū)纖維化程度,與PBS對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

    2.4.2 新生微血管檢測(cè) 在抗 vWAg免疫組化染色的切片上計(jì)數(shù)心肌梗死區(qū)微血管密度結(jié)果顯示,PBS對(duì)照組為(98.6±9.4)/mm2,ADSCs 移植組為(239.6±17.9)/mm2,BADSCs移植組為(215.4±16.7)/mm2。 與 PBS 對(duì)照組血管密度比較,ADSCs移植組及BADSCs移植組心肌梗死區(qū)微血管密度均顯著增加(P<0.05),其中,ADSCs移植組心肌梗死區(qū)微血管密度高于BADSCs組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

    2.4.3 移植細(xì)胞在心肌梗死環(huán)境下的分化 細(xì)胞移植4周后,ADSCs移植組與BADSCs移植組均能在心肌梗死周邊區(qū)域觀察到共表達(dá)cTnT蛋白和mRFP蛋白的細(xì)胞,即同時(shí)表達(dá)綠色熒光與紅色熒光的細(xì)胞。BADSCs移植組更多見紅色與綠色熒光共表達(dá)的細(xì)胞,這說明BADSCs移植組在心肌梗死環(huán)境中的心肌分化程度明顯高于ADSCs移植組。BADSCs能否向血管譜系細(xì)胞分化有待進(jìn)一步研究。見圖6。

    3 討論

    心臟自身具有有限的再生能力。心肌梗死后,損傷的心肌細(xì)胞被巨噬細(xì)胞大量清除并被瘢痕組織取代,這些瘢痕組織由收縮能力較差的存活細(xì)胞包繞,從而引起心力衰竭甚至死亡。研究表明,移植的不同類型干細(xì)胞可以通過旁分泌途徑來修復(fù)受損心臟,然而,干細(xì)胞的旁分泌作用并不會(huì)實(shí)現(xiàn)真正的心臟再生[8]。干細(xì)胞是否可以在體內(nèi)有效地轉(zhuǎn)化為功能性的心血管譜系細(xì)胞值得重視。BADSCs是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的種子細(xì)胞來源。2004年P(guān)lanat-Bénard等[9]首次從小鼠腹股溝及肩胛骨下脂肪中分離出的細(xì)胞能夠自發(fā)的分化為有功能的心肌細(xì)胞,隨后,Yamada等[10]的研究證實(shí),這種具有較高成心肌分化潛能的細(xì)胞主要存在于棕色脂肪組織,從棕色脂肪中分離的CD133陽(yáng)性和CD29陽(yáng)性干細(xì)胞具有高度自發(fā)分化心肌細(xì)胞的能力。為了進(jìn)一步證實(shí)BADSCs是否在體內(nèi)移植后仍具有較強(qiáng)的心肌分化能力及心肌梗死修復(fù)潛能,本研究開展了兩種脂肪來源干細(xì)胞心肌梗死移植及其修復(fù)效果的比較研究。

    已有文獻(xiàn)報(bào)道,ADSCs移植入病損組織會(huì)分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,以旁分泌的方式刺激心肌修復(fù)[11]。本研究亦證實(shí),ADSCs能夠通過其促血管化作用來提高心肌梗死的修復(fù)效果。雖然BADSCs的促血管化作用不如ADSCs,但BADSCs移植后的心功能改善作用與ADSCs無明顯差異。鑒于BADSCs具有高度的心肌分化潛能,本研究比較了其與ADSCs在體內(nèi)的心肌分化能力,結(jié)果表明,BADSCs體內(nèi)移植后仍可以分化為心肌細(xì)胞,且相較于ADSCs在心肌梗死環(huán)境下有更強(qiáng)的心肌再生能力。然而,BADSCs來源的心肌細(xì)胞是否能與宿主心肌在功能上偶聯(lián),尚有待進(jìn)一步研究。除此之外,BADSCs也可以通過旁分泌作用促進(jìn)梗死心肌的修復(fù)。Liu等[6]證實(shí),BADSCs可分泌多種細(xì)胞因子,如促血管生成因子VEGF、抗凋亡因子HGF、抗纖維化因子bFGF等,參與促進(jìn)血管新生、減少心肌細(xì)胞凋亡、抗心肌纖維化、減輕炎癥反應(yīng)等修復(fù)過程。本研究也證實(shí),BADSCs具有一定的促血管化作用。盡管如此,目前,棕色脂肪在成人體內(nèi)數(shù)量很少,然而隨著人們對(duì)干細(xì)胞基礎(chǔ)生物學(xué)研究的不斷深入,有研究發(fā)現(xiàn),棕色脂肪與白色脂肪在一定條件下能夠互相轉(zhuǎn)換,從而有望解決棕色脂肪干細(xì)胞的來源問題[11]。

    本研究證實(shí),BADSCs相較于ADSCs具有如下優(yōu)勢(shì):①高度的成心肌分化能力,可作為優(yōu)良的心肌再生種子細(xì)胞。②與ADSCs有相似的旁分泌潛能。本研究為BADSCs用于心肌梗死移植治療提供了新的數(shù)據(jù)。

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