酵母菌誘導(dǎo)和阻遏分子機(jī)理的研究進(jìn)展＊

池振明，馬再超

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島，266003）

在微生物中誘導(dǎo)和阻遏是非常普遍的代謝調(diào)控現(xiàn)象。在細(xì)菌中尤其在大腸桿菌（Escherichia coli）中誘導(dǎo)和阻遏分子機(jī)理已經(jīng)比較清楚［1］。但是在酵母菌中誘導(dǎo)和阻遏的分子機(jī)理明顯不同于細(xì)菌，許多詳細(xì)的分子機(jī)理，特別是與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的機(jī)理還很不清楚。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和其他許多酵母菌可以在各種碳源中生長(zhǎng)繁殖，但是葡萄糖和果糖是它們生長(zhǎng)的最適碳源。當(dāng)培養(yǎng)基存在其中之一碳源時(shí)，用于分解其他碳源所需的酶合成速率就會(huì)降低或完成不能合成，這種現(xiàn)象就叫做碳代謝物阻遏作用（Carbon catabolite repression）。但是至今還未發(fā)現(xiàn)能起阻遏作用的“非葡萄糖碳代謝物”，所以更多情況下用葡萄糖阻遏作用（Glucose repression）這個(gè)名詞來(lái)代替碳代謝物阻遏作用這個(gè)說(shuō)法［2］。除了葡萄糖阻遏作用外，酵母菌還存在氮代謝物阻遏作用，當(dāng)培養(yǎng)基缺少富氮源如谷氨酰氨、天冬氨酸或氨時(shí)，釀酒酵母可以利用不良氮源（精氨酸、尿素、脯氨酸等）作為氮源。這時(shí)細(xì)胞中的氮阻遏作用可以在轉(zhuǎn)錄水平上得到解除，把這種現(xiàn)象叫做氮代謝物阻遏作用（Nitrogen catabolite repression），簡(jiǎn)稱NCR［3］。許多絲狀真菌和酵母菌生長(zhǎng)在含鐵培養(yǎng)基中時(shí)，鐵載體合成和有關(guān)基因的表達(dá)也會(huì)受到阻遏。當(dāng)釀酒酵母生長(zhǎng)在半乳糖和麥芽糖培養(yǎng)基中時(shí)，與半乳糖和麥芽糖代謝有關(guān)的基因表達(dá)和酶活力便可以得到誘導(dǎo)；同樣當(dāng)產(chǎn)淀粉酶的酵母菌生長(zhǎng)在淀粉、糊精和麥芽糖培養(yǎng)基中時(shí)，淀粉酶基因表達(dá)和產(chǎn)生的淀粉酶活力可以得到誘導(dǎo)；當(dāng)產(chǎn)乳糖酶的酵母菌生長(zhǎng)在乳糖和半乳糖培養(yǎng)基中時(shí)，乳糖酶基因和產(chǎn)生的乳糖酶活力可以得到誘導(dǎo)?，F(xiàn)在一般認(rèn)為阻遏作用是一種影響整個(gè)細(xì)胞全局的代謝調(diào)控現(xiàn)象，也就是說(shuō)一旦細(xì)胞得到葡萄糖解阻遏或氮解阻遏，許多酶的基因表達(dá)和酶活力，甚至許多代謝途徑都可以得到解阻遏，而誘導(dǎo)作用具有特異性，也就是說(shuō)受某種物質(zhì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞只能與該物質(zhì)代謝有關(guān)的基因表達(dá)和酶活力受到誘導(dǎo)，而與其他物質(zhì)代謝有關(guān)的基因表達(dá)和酶活力不會(huì)受到影響。這樣誘導(dǎo)的機(jī)理要比阻遏機(jī)理復(fù)雜的多，所以酵母菌的許多誘導(dǎo)機(jī)理至今仍很不清楚。

1 葡萄糖阻遏的分子機(jī)理

當(dāng)培養(yǎng)基存在葡萄糖或果糖時(shí)，酵母菌代謝其他糖的酶基因表達(dá)和酶合成會(huì)受到阻遏。現(xiàn)在一般認(rèn)為這種阻遏作用主要發(fā)生受葡萄糖阻遏的各種基因轉(zhuǎn)錄水平上。參與葡萄糖阻遏的蛋白質(zhì)有2類，一類叫做Mig1（Multicopy Inhibitor of Galactose，半乳糖多拷貝抑制蛋白），另一類叫做 Snf1（sucrose non－fermentable，蔗糖非發(fā)酵蛋白）復(fù)合物，實(shí)際上Snf1復(fù)合物是一類激酶，它能催化Mig1發(fā)生磷酸化反應(yīng)，也有人認(rèn)為還有一類蛋白屬于連Snf1復(fù)合物激酶激酶，就是能催化Snf1復(fù)合物激酶發(fā)生磷酸化反應(yīng)的酶，但是目前這種Snf1復(fù)合物激酶激酶還未知。Mig1這種蛋白質(zhì)是C2H2鋅指蛋白，它們能結(jié)合在由葡萄糖阻遏的各種基因啟動(dòng)子上，結(jié)合時(shí)啟動(dòng)子上必須有GC盒，含有共有序列（G／C）（C／T）GGGG，但是在與 GC盒連接的DNA 5′－端也應(yīng)含有1個(gè)富含AT的區(qū)域。在酒精酵母細(xì)胞中具有Mig1和Mig2兩種蛋白?，F(xiàn)有證據(jù)表明Mig1蛋白具有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，鋅指結(jié)構(gòu)1能辨認(rèn)G（G／A）G三聯(lián)密碼子，而鋅指結(jié)構(gòu)2能辨認(rèn)（G／C）（C／T）G三聯(lián)密碼子。Snf1復(fù)合物是一種蛋白質(zhì)激酶，在培養(yǎng)基中葡萄糖濃度很低或無(wú)葡萄糖情況下，在Snf復(fù)合物激酶激酶催化下，Snf1復(fù)合物受到磷酸化作用，這時(shí)它可以催化Mig1蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化反應(yīng)，這時(shí)磷酸化的Mig1蛋白質(zhì)便不能與受葡萄糖阻遏的基因啟動(dòng)子結(jié)合，并離開(kāi)細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)中，這樣有關(guān)的基因便得到了解阻遏，并進(jìn)行基因表達(dá)，所以Snf1復(fù)合物在酵母菌葡萄糖阻遏作用過(guò)程中由葡萄糖引起的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著非常重要的作用。在培養(yǎng)基葡萄糖濃度很高的情況下，Snf1復(fù)合物去磷酸化作用，這時(shí)Snf1復(fù)合物是沒(méi)有活性的，Mig1蛋白質(zhì)由于不能受到磷酸化作用，便對(duì)有關(guān)基因，如SUC2（蔗糖酶基因）基因產(chǎn)生阻遏作用［2，4］，如圖1所示。

圖1 Mig1和Snf1作用的模式圖Fig.1 The schema chart of Mig1and Snf1

在這個(gè)過(guò)程中細(xì)胞應(yīng)該能感受培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，所以無(wú)疑還存在由葡萄糖引起的信號(hào)傳導(dǎo)作用，通過(guò)這種信號(hào)傳導(dǎo)作用使Snf1復(fù)合物激酶發(fā)生磷酸化作用還是去磷酸化作用。現(xiàn)在一般認(rèn)為引起葡萄糖阻遏的信號(hào)就是細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖濃度，而不是葡萄糖流入細(xì)胞的速度，所以葡萄糖本身就是1個(gè)信號(hào)分子［2］。

2 磷脂酰肌醇類信號(hào)傳導(dǎo)與葡萄糖阻遏的可能關(guān)系

在酵母菌細(xì)胞中的磷脂主要由磷脂酸（PA）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）和心磷脂CL）組成的。其中的磷脂酰肌醇（PI）的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 磷脂酰肌醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 The chemical structure of PI

本實(shí)驗(yàn)室大量研究結(jié)果表明在釀酒酵母中蔗糖酶分泌導(dǎo)致的葡萄糖解阻遏作用與細(xì)胞中PI含量有某種關(guān)系，同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)釀酒酵母中蔗糖酶分泌的解阻遏作用是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，因?yàn)獒劸平湍阜置诘恼崽敲富盍εc編碼胞外蔗糖酶的mRNA量和PI含量存在有正相關(guān)性。與在釀酒酵母中的情況一樣，當(dāng)粟酒裂殖酵母含有較高PI含量時(shí)，蔗糖酶分泌、細(xì)胞生長(zhǎng)和編碼蔗糖酶的基因表達(dá)在某種程度上得到了葡萄糖解阻遏作用，并且這種葡萄糖解阻遏作用認(rèn)為與細(xì)胞中較高濃度的PI含量有密切的關(guān)系。粟酒裂殖酵母的麥芽糖酶是胞內(nèi)酶，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酵母菌的磷脂酰肌醇含量與粟酒裂殖酵母麥芽糖酶基因的表達(dá)和麥芽糖酶活力也有某種關(guān)系。當(dāng)酒裂殖酵母細(xì)胞PI含量增加時(shí)，能夠解除高濃度葡萄糖對(duì)麥芽糖酶活力和麥芽糖酶基因表達(dá)的阻遏作用［4－6］。

在酵母菌細(xì)胞中，PI在激酶催化下通過(guò)依賴ATP的磷酸化作用（ATP－dependent phosphorylation）可分別在肌醇分子的第4位和第5位上發(fā)生磷酸化反應(yīng)，形成4，5－二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）。當(dāng)細(xì)胞外的某些刺激物與細(xì)胞質(zhì)膜表面的受體結(jié)合后，可以活化對(duì)磷脂酰肌醇特異的磷脂酶C（Phosphatidylinoside－specific phospholipase C，簡(jiǎn)稱PLC），在細(xì)胞質(zhì)膜上的PLC把PIP2裂解成具有第二信使功能的1，4，5－三磷酸肌醇（IP3）和CDP－二酰基甘油（CDP－DAG）。由于IP3是可溶性的，它便從細(xì)胞質(zhì)膜上進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，這時(shí)便引起細(xì)胞內(nèi)的鈣離子庫(kù)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子庫(kù)得到釋放，細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度的增加可以活化細(xì)胞中許多酶，如蛋白質(zhì)激酶（Protein kinase C，簡(jiǎn)稱PKC）的轉(zhuǎn)位和激活，但是PKC的完全激活還需要DAG和磷脂酰絲氨酸（PS）。PKC激活后會(huì)引起pH和細(xì)胞膜的一系列變化［4］。根據(jù)這種PI類信號(hào)傳導(dǎo)的原理，把PI類信號(hào)傳導(dǎo)與上述的PI含量與葡萄糖解阻遏的關(guān)系聯(lián)系在一起，在培養(yǎng)基中添加肌醇或酵母細(xì)胞合成更多的肌醇，引起酵母菌細(xì)胞中的PI含量增加，這時(shí)即使酵母細(xì)胞生長(zhǎng)在高濃度葡萄糖培養(yǎng)基中，酵母細(xì)胞中PI含量的增加通過(guò)PI類的信號(hào)傳導(dǎo)作用還可以激活Snf1復(fù)合物激酶激酶，使Snf1復(fù)合物發(fā)生磷酸化反應(yīng)，并同時(shí)導(dǎo)致Mig1發(fā)生磷酸化反應(yīng)而被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，這樣便引起蔗糖酶和麥芽糖基因表達(dá)和蔗糖酶和麥芽糖分泌進(jìn)而發(fā)生葡萄糖解阻遏作用。

3 葡萄糖解阻遏與酵母菌酶的合成和調(diào)控

扣囊復(fù)膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）是子囊菌屬的1個(gè)種，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中可以出現(xiàn)絲狀細(xì)胞和酵母狀細(xì)胞，是一種二形態(tài)酵母菌，它可以利用淀粉積累大量的海藻糖，并能分泌大量的淀粉酶、酸性蛋白酶、β－葡糖苷酶和其它酶。所以扣囊復(fù)膜酵母在發(fā)酵行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)和生物能源工業(yè)有著巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值［4］。在有葡萄糖存在情況下，該酵母菌許多酶的合成和基因表達(dá)都會(huì)受到阻遏。為了了解Mig1蛋白在該酵母菌葡萄糖阻遏中的作用，從扣囊復(fù)膜酵母A11菌株的基因組DNA中克隆出了MIG1基因?？寺〉腗IG1基因（NCBI的登錄號(hào)：HM450676）全長(zhǎng)1 152bp，編碼由384個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與其它真菌的Mig1s非常類似，有高度保守的2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，這2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)可以與受葡萄糖阻遏的基因啟動(dòng)子結(jié)合。在該Mig1蛋白的N－末端，有1個(gè)KPTLK的氨基酸序列，該序列決定了該蛋白可以在細(xì)胞核中定位［8］。另外該蛋白第二鋅指結(jié)構(gòu)中還有1個(gè)KRFS氨基酸序列，它是依賴環(huán)化AMP的蛋白激酶催化的磷酸化位點(diǎn)。該蛋白也有1個(gè)含有多個(gè)谷氨酰氨的序列，所有這些特征都是Mig1蛋白必須具備的。獲得該酵母MIG1基因后，就敲除該菌株的MIG1基因，獲得了敲除菌株A11－c，它能在含有2－脫氧－D葡萄糖的平板上生長(zhǎng)，而原始菌株A11則都不能，說(shuō)明敲除菌株的葡萄糖阻遏得到了解除。與菌株A11相比，敲除菌株A11－c在72h內(nèi)產(chǎn)生的α－淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、酸性蛋白酶和β－葡糖苷酶比活力達(dá)到了89.11，17.42，2.12 和0.20U／mg菌體干重，而野生型A11菌株在同樣條件下在72h內(nèi)產(chǎn)生的α－淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、酸性蛋白酶和β－葡糖苷酶比活力僅達(dá)到了41.26，9.76，1.63和0.16U／mg菌體干重。同時(shí)編碼α－淀粉酶、葡糖淀粉酶、酸性蛋白酶和β－葡糖苷酶基因的表達(dá)量也有極大提高，由野生型A11菌株的100%α－淀粉酶、葡糖淀粉酶、酸性蛋白酶和β－葡糖苷酶基因的表達(dá)量提高到敲除菌株A11－c的271.2%，308.6%，190.7%和468.7%α－淀粉酶、葡糖淀粉酶、酸性蛋白酶和β－葡糖苷酶基因的表達(dá)量。同時(shí)發(fā)現(xiàn)敲除菌株A11－c在生長(zhǎng)過(guò)程中多數(shù)細(xì)胞呈酵母狀細(xì)胞，絲狀細(xì)胞非常少，說(shuō)明MIG1基因的敲除還可以改變?cè)摻湍讣?xì)胞的形態(tài)，其中的原理還不清楚。這就證明，扣囊復(fù)膜酵母中的Mig1蛋白確實(shí)能阻遏某些基因的轉(zhuǎn)錄，它對(duì)一些基因的表達(dá)和一些胞外酶的生產(chǎn)起負(fù)調(diào)控作用［9］。

Kluyveromyces marxianus是1種能進(jìn)行同宗接合的半子囊酵母菌，在親緣關(guān)系方面與釀酒酵母關(guān)系比較近，它是 Kluyveromyces lactis 的姐妹種［10－11］。該酵母最重要的特征是能夠同化乳糖和菊糖，并能利用這2種糖作為碳源［12］。由于K.marxianus能同化乳糖和菊糖、生長(zhǎng)速率非常快、代時(shí)短、具有抗熱性和具有很強(qiáng)的分泌蛋白質(zhì)的能力，所以被廣泛應(yīng)用在生物技術(shù)領(lǐng)域。該酵母菌被公認(rèn)為是最安全的微生物，所以有關(guān)該酵母菌的產(chǎn)品在實(shí)際應(yīng)用中沒(méi)有任何限制，這樣該酵母菌在生物技術(shù)領(lǐng)域中就更加廣泛了。該酵母產(chǎn)生的乳糖酶和纖維二糖酶是胞內(nèi)酶，產(chǎn)生的菊糖酶是與細(xì)胞壁結(jié)合。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)該酵母的乳糖酶、菊糖酶和其他酶合成和分泌也受到葡萄糖阻遏，并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白（Mig1）在葡萄糖阻遏作用中起非常重要的作用［12］。所以利用含有潮霉素抗性 HPT基因的ORF框替換了工業(yè)酵母菌K.marxianus KM 的MIG1基因ORF框，獲得的敲除突變株（mig1突變株）KM－15能夠分別生長(zhǎng)在含有潮霉素和2－脫氧－D－葡萄糖培養(yǎng)基上。與K.marxianus KM相比，突變株的β－半乳糖苷酶，菊糖酶和纖維二糖酶合成和這些酶基因的表達(dá)得到很大提高。敲除突變株KM－15產(chǎn)生的β－半乳糖苷酶，菊糖酶和纖維二糖酶比活力在48h內(nèi)達(dá)到了7.2，5.7和0.06U／mg菌體干重，而K.marxianus KM在同樣條件下β－半乳糖苷酶，菊糖酶和纖維二糖酶比活力在48h內(nèi)達(dá)到了3.4、2.5和0.01U／mg菌體干重。β－半乳糖苷酶，菊糖酶和纖維二糖酶基因的表達(dá)量由K.marxianus KM的100%增加到敲除突變株 KM－15的205.5%，298%和699.6%［13］。這些研究結(jié)果表明Mig1蛋白可以調(diào)節(jié)工業(yè)酵母菌胞內(nèi)酶和細(xì)胞壁結(jié)合酶的合成和它們基因的表達(dá)，MIG1基因的敲除可以解除這些酶的合成和基因表達(dá)，大大提高酶的產(chǎn)量。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該酵母β－半乳糖苷酶，菊糖酶和纖維二糖酶的合成分別受到了乳糖，菊糖和纖維二糖的誘導(dǎo)［13］。上述2個(gè)例子說(shuō)明在產(chǎn)工業(yè)用酶酵母菌中敲除MIG1基因是提高酶產(chǎn)量的重要方法之一。

4 在鐵載體合成過(guò)程中阻遏機(jī)理的研究

鐵在所有生命過(guò)程中具有非常重要的作用。但是細(xì)胞中過(guò)量的鐵也是有害的，所以生物體內(nèi)的鐵濃度必須進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)節(jié)。鐵在自然界中是1種非常豐富的元素，但是生物可利用的鐵量卻非常有限，濃度不超過(guò)10～18mol／L。在鐵濃度非常低的情況下，大多數(shù)真菌可以分泌一種特異絡(luò)合鐵的小分子化合物，即鐵載體（Siderophore），從而使環(huán)境中的鐵以可溶性的形式存在。鐵載體可以分為3類：（1）兒茶酚類（Catechols）；（2）羧酸類（Carboxylates）和（3）羥肟酸類（Hydroxamates）。但是真菌一般僅產(chǎn)生羥肟酸類鐵載體［14］。當(dāng)鐵載體絡(luò)合三價(jià)鐵離子后，便被真菌吸收，在細(xì)胞內(nèi)三價(jià)鐵離子被還原成二價(jià)鐵離子，然后二價(jià)鐵離子被細(xì)胞利用。所有真菌的鐵載體合成都是從L－鳥氨酸（L－ornithine）開(kāi)始，第一步反應(yīng)是L－鳥氨酸的N5發(fā)生羥基化形成 N5－羥基－L－鳥氨酸（N5－h(huán)ydroxyornithine），參與催化的酶是 L－鳥氨酸－N5－羥化酶 （L－orinithine－N5－xoygenase），從某些絲狀真菌中，如曲霉中已經(jīng)克隆到編碼該酶的基因，稱為SidA或Sid1，發(fā)現(xiàn)在霉菌中這些基因的表達(dá)受到鐵離子的嚴(yán)重阻遏。第二步反應(yīng)是N5－羥基－L－鳥氨酸發(fā)生烷基化反應(yīng)，形成 N5－烷基－N5－羥基－L－鳥氨酸，N5－烷基－N5－羥基－L－鳥氨酸是羥肟酸鐵載體合成的基本單位。多個(gè)N5－烷基－N5－羥基－L－鳥氨酸基本單位通過(guò)非核糖體肽鍵合成酶（NRPSs）的縮合作用形成含有多個(gè)肽鍵的鏈狀或環(huán)狀化合物，如玫紅酵母酸（Rhodotorulic acid）等，如圖3所示。

圖3 真菌鐵載體合成的基本過(guò)程Fig.3 The biosynthesis of siderophore in fungi

在真菌中參與由鐵引起的阻遏作用的蛋白是轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白，叫做GATA蛋白，這些蛋白含有GATA類型的鋅指結(jié)構(gòu)，從而可以與鐵載體合成和鐵吸收有關(guān)基因的啟動(dòng)子結(jié)合。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Ustilago maydis URBS1，N.crassa SRE，P.chrysogenumSREP，A.nidulans SREA 和 Schizosaccharomyces pombe GAF2p都被鑒定為GATA蛋白，這類蛋白在大多數(shù)真菌中參與了鐵載體合成和運(yùn)輸?shù)呢?fù)調(diào)控作用，它們都有一對(duì)鋅指結(jié)構(gòu)域，以便與有關(guān)基因啟動(dòng)子中含有HGATAR序列的順式片段（cis－elements）結(jié)合（其中H代表堿基A，T或C，R代表任何一個(gè)嘌呤）。比如在S.pombe中Fep1可以結(jié)合在該酵母所有已知編碼鐵吸收蛋白基因，包括frp1（還原酶），fio1（鐵氧化還原酶），fip1（滲透酶），和鐵受體基因str1－3的5′－非編碼區(qū)5′－（A／T）GATAA－3′序列上，如圖4所示。但是這些GATA蛋白如何與細(xì)胞中鐵結(jié)合后才能結(jié)合DNA或蛋白質(zhì)上或鐵離子的存在如何影響到這些GATA蛋白與有關(guān)DNA結(jié)合現(xiàn)在還不清楚。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明純化的重組Fep1蛋白在有鐵絡(luò)合物存在情況下不能結(jié)合在含有HGATAR序列的順式片段上，所以說(shuō)Fep1與DNA結(jié)合是依賴于鐵離子的存在。也有人認(rèn)為這類蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)能直接與鐵結(jié)合或通過(guò)鐵－硫簇（Iron－sulphur cluster）與鐵結(jié)合。根據(jù)上述5種阻遏蛋白（fep1，SRE，SREA，Urbs1和Sfu1）共有的氨基酸序列G（S／T）CPG（D／G）GXCNTGG，通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)它們的核心序列是GSCPGDGLCNGTGG，這是這些依賴鐵進(jìn)行轉(zhuǎn)錄阻遏的蛋白特有的保守序列。在某些情況下，這些蛋白必須與共阻遏蛋白，如圖4所示的Tup11或Tup12一起才能發(fā)揮功能，所以這些GATA蛋白是作為多蛋白復(fù)合物的一部分發(fā)揮功能，如圖4所示。

圖4 通過(guò)GATA蛋白Fep1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的模式圖Fig.4 Schema chart of the transcriptional regulation through GATA protein Fep1

Fep1是裂殖酵母菌中許多基因的1種轉(zhuǎn)錄共阻遏蛋白，負(fù)責(zé)鐵吸收的調(diào)控作用。這類蛋白能通過(guò)一對(duì)鋅指結(jié)構(gòu)域特異地與順式片段（GATA Box）結(jié)合，這種結(jié)合作用是在鐵過(guò)量情況下進(jìn)行的，結(jié)合后與鐵載體合成和鐵運(yùn)輸有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成就受到阻遏。當(dāng)培養(yǎng)基缺鐵時(shí)，F(xiàn)ep1離開(kāi)GATA Box，與鐵載體合成和鐵運(yùn)輸有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成就開(kāi)始合成。

本實(shí)驗(yàn)室從海洋酵母菌種庫(kù)的300多株海洋酵母中利用高氯酸鐵檢測(cè)的方法篩選得到14株產(chǎn)鐵載體的酵母，經(jīng)過(guò)復(fù)篩得到一株鐵載體產(chǎn)量較高的海洋酵母菌菌株HN6.2，該菌株分離自青島東風(fēng)鹽場(chǎng)近海表層海水。通過(guò)鑒定，發(fā)現(xiàn)該株海洋酵母菌屬于普魯蘭類酵母（Aureobasidium pullulans）。在最佳條件下培養(yǎng)，HN6.2菌株的鐵載體最高產(chǎn)量可達(dá)到1.1mg／mL。在產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基中加入L－鳥氨酸后鐵載體的產(chǎn)量明顯增加，而加入Fe3＋后，其產(chǎn)量明顯減少。并且，從分子水平上檢測(cè)到了L－鳥氨酸－N－羥基化酶基因在加有L－鳥氨酸培養(yǎng)基中表達(dá)量上升，而加有Fe3＋情況下該基因表達(dá)量非常低。該菌株HN6.2產(chǎn)生的鐵載體對(duì)海洋鰻弧菌V.P、海洋副溶血弧菌 W－1和枯草桿菌具有明顯的抑菌活性，并且對(duì)海洋鰻弧菌V.P的抑菌活性最大。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)Fe3＋對(duì)鐵載體的抑菌作用具有抑制作用。該鐵載體的熱穩(wěn)定性很強(qiáng)，對(duì)鐵載體進(jìn)行加熱處理后，仍具有同樣的抑菌活性［15］。經(jīng)過(guò)純化、紅外光譜和質(zhì)譜法分析，發(fā)現(xiàn)該鐵載體的結(jié)構(gòu)組分是異羥肟酸類Fusigen，如圖5所示［16］。純化的鐵載體仍具有抑菌活性。

從圖5的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以看出Fusigen合成的第一步反應(yīng)也是L－鳥氨酸的5位N原子發(fā)生羥基化形成N5－羥基－L－鳥氨酸，但是在該鐵載體合成過(guò)程中 N5－羥基－L－鳥氨酸不發(fā)生烷基化反應(yīng)，而是 N5－羥基－L－鳥氨酸直接作為鐵載體合成的基本單位。3個(gè)N5－羥基－L－鳥氨酸基本單位通過(guò)非核糖體肽鍵合成酶（NRPSs）的縮合作用形成含有3個(gè)酯鍵的環(huán)狀化合物（見(jiàn)圖5）。目前該L－鳥氨酸－N－羥基化酶基因包括上游的非編碼區(qū)和下游的終止序列已經(jīng)得到了克隆，命名為SidA基因，登錄號(hào)為FJ769160。該基因的ORF框大小為1 461bp，編碼1個(gè)由486個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)（等電點(diǎn)7.79），推測(cè)的分子量為55.4kD。該基因（無(wú)內(nèi)含子）啟動(dòng)子位于－1～－824bp，并且具有3個(gè)HGATAR boxes和1個(gè)CATA box，推測(cè)前者就是阻遏蛋白（GATA蛋白）結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，所以就出現(xiàn)了上述的由鐵離子引起的鐵載體合成和L－鳥氨酸－N－羥基化酶基因表達(dá)的阻遏現(xiàn)象。把該基因敲除后獲得的敲除菌株S6（ΔsidA）不能合成胞內(nèi)和胞外的鐵載體，所以培養(yǎng)的上清液不能抑制病原菌Vibrio anguillarum 和Vibrio parahaemolyticus的生長(zhǎng)。敲除菌株S6在完全缺鐵的培養(yǎng)基上和海水中因?yàn)榧?xì)胞出芽停止不能生長(zhǎng)，但是在培養(yǎng)基添加上10μmol／L Fe3＋和Fe2＋后就可以生長(zhǎng)。與野生型菌株相比，培養(yǎng)基中的H2O2對(duì)敲除菌株的毒性要大得多，因?yàn)樵诩?xì)胞中沒(méi)有鐵載體來(lái)儲(chǔ)存鐵，這樣過(guò)多的鐵會(huì)導(dǎo)致過(guò)量過(guò)氧化合物的形成。所以推測(cè)該酵母產(chǎn)生的鐵載體fusigen在絡(luò)合、吸收和濃縮鐵方面能發(fā)揮獨(dú)特的作用，以維持細(xì)胞某些特殊的生理功能。另外該酵母能分泌具有抑制其他微生物生長(zhǎng)的鐵載體，這樣可以排除競(jìng)爭(zhēng)者，在海洋環(huán)境中能更好地獲得有限的營(yíng)養(yǎng)物［17］。

5 氮阻遏機(jī)理的研究現(xiàn)狀

在釀酒酵母中所有與氮代謝（包括谷氨酰氨、谷氨酸、脯氨酸、尿素、精氨酸、含氮的γ－氨基丁酸（GABA）和尿囊素合成）有關(guān)的已知途徑受到了4個(gè)調(diào)節(jié)蛋白Gln3，Gat1，Dal80和Deh1的調(diào)控，這些蛋白可以結(jié)合到受調(diào)控基因啟動(dòng)子的共有序列5′－GATAA－3′上。Gln3和Gat1結(jié)合有利于有關(guān)基因的表達(dá)，所以它們是轉(zhuǎn)錄激活蛋白，而Dal80和Deh1的結(jié)合不利于有關(guān)基因的表達(dá)，所以它們是轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白。另外氨基酸滲透酶和氨滲透酶基因的表達(dá)也受到這4個(gè)蛋白的調(diào)控。該酵母蛋白酶基因的表達(dá)同樣也受到Gln3，Gat1，Dal80和Deh1的調(diào)節(jié)，因?yàn)檫@些基因編碼的蛋白酶可以把蛋白質(zhì)降解成氨基酸，從而給細(xì)胞提供氮源，這樣培養(yǎng)基存在這些氨基酸同樣也會(huì)產(chǎn)生氮阻遏和解阻遏作用。谷氨酸和谷氨酰氨是細(xì)胞合成所有氨基酸的前體物。當(dāng)培養(yǎng)基中不存在谷氨酰氨、天冬氨酸或氨時(shí)，編碼合成脯氨酸、尿素、精氨酸、含氮的γ－氨基丁酸（GABA）和尿囊素合成的基因表達(dá)可以在轉(zhuǎn)錄水平上得到解阻遏，因?yàn)榧?xì)胞無(wú)法直接從谷氨酰氨、天冬氨酸或氨合成其他的氨基酸。Gln3含有730氨基酸，在306～330氨基酸區(qū)域中有1個(gè)Cys2／Cys2鋅指結(jié)構(gòu)，它能結(jié)合在含有5′－GATA／TA－3′Gln3DNA 序列中，把這段序列叫做上游激活序列UASNTR。在含有谷氨酰氨、天冬氨酸或氨的阻遏培養(yǎng)基中，Gln3的功能受到阻遏，其中谷氨酰氨是引起阻遏的信號(hào)分子，當(dāng)天冬氨酸或氨被轉(zhuǎn)化成谷氨酰氨時(shí)能起同樣的作用。Gat1是能引起氮阻遏途徑基因解阻遏的第二個(gè)激活蛋白，像Gln3蛋白一樣，Gat1也含有1個(gè)與DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)，但是當(dāng)培養(yǎng)基中谷氨酸濃度增加時(shí)Gat1失去活力，而氨濃度增加時(shí)Gat1具有活力。像Gln3蛋白一樣，作為1種阻遏蛋白Dal80能結(jié)合在啟動(dòng)子含有5′－GATAA－3′的DNA序列中；這些DNA序列被命名為上游阻遏序列URSGATA。編碼Dal80的基因DAL80含有807個(gè)堿基，編碼269個(gè)氨基酸。如果氮代謝途徑的基因啟動(dòng)子含有URSGATA序列，Dal80能夠阻遏這些基因表達(dá)。如果啟動(dòng)子中的2個(gè)5′－GATAA－3′序列是尾對(duì)尾或頭對(duì)頭相連，那么 Dal80結(jié)合在URSGATA上最為牢固?；駾AL80的表達(dá)依賴于Gln3，在含有脯氨酸解阻遏培養(yǎng)基中它會(huì)阻遏它自己的表達(dá)。在含有谷氨酰氨、天冬氨酸和氨的阻遏培養(yǎng)基中它不會(huì)影響GLN3，GAT1或DEH1基因的表達(dá)，但是在解阻遏培養(yǎng)基中會(huì)影響GLN3，GAT1或DEH1基因的表達(dá)。與Dal80一樣，在含有谷氨酰氨、天冬氨酸和氨的豐富培養(yǎng)基（阻遏培養(yǎng)基）中產(chǎn)生的Deh1是一種阻遏蛋白，能阻遏與氮代謝過(guò)程中的許多基因表達(dá)。它含有551個(gè)氨基酸，與Dal80有很高的同源性：C－末端有1個(gè)假定的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（Putative leucine zipper）和鋅指結(jié)構(gòu)，這些鋅指結(jié)構(gòu)與其他真菌和人類的Gln3，Gat1，Dal80和各種GATA因子有很高的同源性。與Gln3和Gat1所不同的是，Deh1和Dal80沒(méi)有酸性區(qū)域，所以不能參與轉(zhuǎn)錄激活作用［3］。

上述能與GATA結(jié)合的蛋白質(zhì)是氮代謝物途徑中的4種主要調(diào)節(jié)蛋白，所有這些蛋白具有很高的同源序列，都能辨認(rèn)啟動(dòng)子中的5′－GATAA－3′的序列。Dal80和 Deh1與啟動(dòng)子中的5′－GATAA－3′序列結(jié)合后，能拮抗Gln3和Gat1的結(jié)合，所以阻遏了許多基因的轉(zhuǎn)錄，所有這些調(diào)節(jié)蛋白都存在于阻遏和解阻遏培養(yǎng)基中，但是在解阻遏培養(yǎng)基中Gln3和Dal80是主要的調(diào)節(jié)蛋白，而在阻遏培養(yǎng)基中Gat1和Deh1是主要的調(diào)節(jié)蛋白。通過(guò)這種方式完成完全阻遏（含有谷氨酰氨）到完全解阻遏（含有脯氨酸）過(guò)程［3］。

6 誘導(dǎo)機(jī)理的研究現(xiàn)狀

與阻遏現(xiàn)象一樣，酵母菌許多酶的合成和代謝途徑都會(huì)受到底物的誘導(dǎo)?，F(xiàn)在認(rèn)為在酵母菌誘導(dǎo)過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄激活蛋白（Transcriptional activator）起著非常關(guān)鍵的作用，轉(zhuǎn)錄激活蛋白最重要的特征是含有鋅指結(jié)構(gòu)，能與許多基因的啟動(dòng)子結(jié)合，起轉(zhuǎn)錄激活作用。這類蛋白還有一個(gè)很重要的特征就是有特異性，就是一種轉(zhuǎn)錄激活蛋白只能調(diào)控一種物質(zhì)的代謝。它們可以分為3類，第一類是C2H2蛋白，這類蛋白共有的氨基酸序列是 Cys－X2－4－Cys－X12－His－X3－5－His；第二類是C4蛋白，這類蛋白共有的氨基酸序列如下：Cys－X2－Cys－Xn－Cys－X2－Cys－Xn－Cys－X2－Cys－Xn－Cys－X2－Cys；第三類是C6蛋白，這類蛋白共有的氨基酸序列如下：Cys－X2－Cys－X6－Cys－X5－12－Cys－X2－Cys－X6－8－Cys， 這類鋅指蛋白含有6個(gè)半胱氨酸和2個(gè)鋅原子，所以通常被稱作為Zn（II）2Cys6或者（Zn2C6），它們是真菌中特有的轉(zhuǎn)錄激活蛋白。轉(zhuǎn)錄激活蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化非常大，并且功能多樣。指狀結(jié)構(gòu)實(shí)際上是由1個(gè)α－螺旋和1對(duì)反平行β－折疊鏈組成的。通常情況下，有1個(gè)或多個(gè)鋅原子與氨基酸Cys或His結(jié)合，這種結(jié)合有利于結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性，并且對(duì)該類蛋白有合適的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的作用［18］。

轉(zhuǎn)錄激活蛋白除了具有富含半胱氨酸的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domains，DBD）外，還有調(diào)節(jié)和激活結(jié)構(gòu)域，如圖6所示。轉(zhuǎn)錄激活蛋白的功能結(jié)構(gòu)域包括鋅指（Zinc finger）、接頭（Linker）、二聚體區(qū)域（Dimerization）、調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域（Regulatory domain）和酸性區(qū)域（激活結(jié)構(gòu)域）（Aciddic region），其中鋅指、接頭和二聚體區(qū)域3部分統(tǒng)稱為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域DBD。鋅指一般位于N－末端，負(fù)責(zé)與被誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子的結(jié)合，它所辨認(rèn)的啟動(dòng)子一般含有CGG三聯(lián)密碼子，當(dāng)然該三聯(lián)密碼子附近的核苷酸也會(huì)在某種程度上影響DBD與DNA結(jié)合的親和力，另外該三聯(lián)密碼子的方向性和三聯(lián)密碼子之間的空間對(duì)于DBD與DNA結(jié)合也有影響。接頭決定了DBD與被誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子結(jié)合的特異性。二聚體區(qū)域決定了2個(gè)轉(zhuǎn)錄激活蛋白同時(shí)結(jié)合到被誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子上，并且對(duì)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用起某種作用。調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活蛋白的轉(zhuǎn)錄活力方面起某種作用。酸性區(qū)域通常位于C－末端，主要的功能是作為激活結(jié)構(gòu)域，它們不是很保守的結(jié)構(gòu)域，并且結(jié)構(gòu)功能多樣［18］。

圖6 轉(zhuǎn)錄激活蛋白的功能結(jié)構(gòu)域Fig.6 The functional domain of transcriptional activator

在有誘導(dǎo)物存在情況下，酵母菌轉(zhuǎn)錄激活蛋白如何激活有關(guān)基因的表達(dá)現(xiàn)在還不完全清楚。這方面研究最多的是酒精酵母中與半乳糖代謝有關(guān)的Gal4p這種轉(zhuǎn)錄激活蛋白。這種激活蛋白可以激活與半乳糖和蜜二糖代謝有關(guān)的一系列基因表達(dá)，如GAL1，GAL2，GAL7，GAL10和MEL1。在沒(méi)有DNA存在情況下，Gal4p是以單體的形式存在，當(dāng)它的鋅指與DNA含有CCG三聯(lián)密碼子結(jié)合時(shí)是以二聚體的形式存在。Gal4p可以與調(diào)節(jié)蛋白Gal80形成一個(gè)復(fù)合物，這種復(fù)合物的形成需要Gal4p蛋白C－末端存在的30個(gè)氨基酸［2，18］。

在培養(yǎng)基沒(méi)有半乳糖存在情況下，這種復(fù)合物可以與受誘導(dǎo)基因的上游激活序列UASGAL結(jié)合，但是這時(shí)不能激活轉(zhuǎn)錄作用（見(jiàn)圖7A）［2，18］。

當(dāng)培養(yǎng)基中存在半乳糖時(shí)，一種類似于半乳糖激酶的調(diào)控蛋白Gal3p首先與半乳糖結(jié)合，然后再與Gal4p－Gal80復(fù)合物結(jié)合，從而解除了Gal80對(duì)Gal4p活力的抑制作用，有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄便開(kāi)始（見(jiàn)圖7B）。Gal3p－半乳糖復(fù)合物能影響GAL基因的表達(dá)是由于這種復(fù)合物能使Gal4p－Gal80p復(fù)合物發(fā)生構(gòu)象變化，從而使Gal4p的激活結(jié)構(gòu)域能和普通的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用。在沒(méi)有半乳糖存在情況下，Gal80可以通過(guò)改變激活結(jié)構(gòu)域而抑制 Gal4p活力［2，18］。

Gal4p蛋白上的許多氨基酸可以得到磷酸化反應(yīng)。在不受誘導(dǎo)情況下，磷酸化和去磷酸化的Gal4p形式都可以存在于細(xì)胞中。在有誘導(dǎo)物半乳糖存在情況下，Gal4p其中之一的氨基酸（Ser－699）出現(xiàn)磷酸化后，這時(shí)Gal4p具有激活有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄作用，Ser－699氨基酸發(fā)生磷酸化作用對(duì)于Gal4p發(fā)生最大的轉(zhuǎn)錄激活作用能起關(guān)鍵的作用（見(jiàn)圖7C）。RNA Pol II全酶中的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（The cyclin－dependent protein kinases of the RNA Pol II holoenzyme）參與了這種磷酸化作用。在上述磷酸化過(guò)程中，還有一個(gè)蛋白還參與了作用，那就是Srb10p，在Srb10p有活力情況下，Gal4p的Ser－699才能發(fā)生磷酸化作用，從而使Gal4p－Gal80p復(fù)合物處在有活力的構(gòu)象，如果Srb10p能使Gal4p發(fā)生磷酸化作用，那么Srb10p就可以加快GAL基因的誘導(dǎo)作用（見(jiàn)圖7C）［2，18］?，F(xiàn)在的問(wèn)題是半乳糖的存在如何使Gal4p的Ser－699發(fā)生磷酸化反應(yīng)，其中有可能發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)作用。

當(dāng)培養(yǎng)基中存在葡萄糖時(shí)，這時(shí)培養(yǎng)基中即使有半乳糖存在，與半乳糖代謝有關(guān)的GAL基因轉(zhuǎn)錄也會(huì)受到阻遏。葡萄糖可以在不同水平上作用于Gal4p，通過(guò)Mig1蛋白質(zhì)阻遏它的合成，如上述、阻止它與上游激活序列UASGAL的結(jié)合、干擾Gal4p的激活功能。另外還會(huì)干擾半乳糖－Gal3－Gal4p－Gal80復(fù)合物抑制作用的解除。另外一種可能是由于在有Gal80存在情況下，葡萄糖可以抑制Gal4p發(fā)生磷酸化作用［2，18］。

在非誘導(dǎo)情況下（沒(méi)有加半乳糖情況下），轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4p活力受到負(fù)調(diào)控蛋白Gal80p的抑制（A）。當(dāng)加入半乳糖后（B），半乳糖與Gal3p結(jié)合成復(fù)合物，該復(fù)合物與Gal80p相互作用導(dǎo)致Gal4p構(gòu)象發(fā)生瞬間變化，使得Gal4p轉(zhuǎn)錄激活蛋白具有激活轉(zhuǎn)錄作用。在與RNA Pol II全酶作用過(guò)程中（C），轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4p的Ser－699受到Srb10p的磷酸化作用，這種磷酸化作用使得受Gal3p－半乳糖誘導(dǎo)的Gal4p－Gal80p構(gòu)象得到激活，這樣激活有關(guān)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4p中的Ser－699受到Srb10p的磷酸化作用是受到單獨(dú)的環(huán)境信號(hào)調(diào)［2，18］。

圖7 釀酒酵母半乳糖酶的誘導(dǎo)機(jī)理Fig.7 The induction mechanism of GAL in S.cerevisae

7 展望

從上述情況來(lái)看，目前僅對(duì)釀酒酵母誘導(dǎo)機(jī)理有所了解。同時(shí)發(fā)現(xiàn)參與誘導(dǎo)作用的關(guān)鍵組分轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因表達(dá)也受到葡萄糖阻遏。轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白Mig1可以調(diào)控細(xì)胞中許多受葡萄糖阻遏的基因表達(dá)，但是轉(zhuǎn)錄激活蛋白對(duì)調(diào)控的基因具有特異性，比如說(shuō)Gal4p只能調(diào)控釀酒酵母半乳糖和蜜二糖的代謝，對(duì)其他物質(zhì)的代謝沒(méi)有調(diào)控作用。目前許多酵母菌糖代謝和活性物質(zhì)代謝也受到了誘導(dǎo)調(diào)控，如上述的扣囊復(fù)膜酵母菌淀粉酶合成、纖維二糖酶合成和酸性蛋白酶合成分別受到淀粉、糊精、麥芽糖、纖維二糖和蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)、馬克斯克魯氏酵母菌乳糖酶合成、菊糖酶合成和纖維二糖酶合成受到乳糖、半乳糖、菊糖、蔗糖、纖維二糖的誘導(dǎo)、另有一株普魯蘭酵母鐵載體合成受鳥氨酸誘導(dǎo)。這些酵母的誘導(dǎo)機(jī)理是否與酒精酵母的Gal4p調(diào)控作用一樣，現(xiàn)在還一無(wú)所知。這就需要人們?cè)谶@些酵母菌克隆更多的轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因，并通過(guò)基因敲除實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因與誘導(dǎo)的關(guān)系。這些轉(zhuǎn)錄激活蛋白與基因啟動(dòng)子的結(jié)合是否需要淀粉、糊精、麥芽糖、蛋白質(zhì)、纖維二糖、乳糖、半乳糖、菊糖、蔗糖和鳥氨酸的參與；在培養(yǎng)基中的淀粉、糊精、麥芽糖、蛋白質(zhì)、纖維二糖、乳糖、半乳糖、菊糖、蔗糖和鳥氨酸與轉(zhuǎn)錄激活蛋白的磷酸化和有關(guān)基因的表達(dá)存在何種關(guān)系；轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因的表達(dá)與葡萄糖阻遏之間的關(guān)系如何；在不同酵母菌中和不同物質(zhì)引起的誘導(dǎo)機(jī)理是否一樣；在不同轉(zhuǎn)錄激活蛋白中哪一種對(duì)有關(guān)的基因表達(dá)誘導(dǎo)最有效；過(guò)量表達(dá)這種轉(zhuǎn)錄激活蛋白是否可以增加有關(guān)酶的產(chǎn)量，所有這些問(wèn)題都是將來(lái)需要進(jìn)行深入的研究。同樣許多阻遏機(jī)理也完全未知，如上述在鐵載體合成過(guò)程中由GATA蛋白參與的阻遏作用是否需要鐵離子存在，鐵離子如何與GATA蛋白結(jié)合，然后發(fā)揮阻遏有關(guān)基因表達(dá)的作用。

［1］ 沈萍，陳向東.微生物學(xué) ［M］.北京：高等教育出版社，2006：238－243.

［2］ Gancedo J M.Yeast carbon catabolite repression［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998，62：334－361.

［3］ Hofman－Bang J.Nitrogen catabolite repression in Saccharomyces cerevisiae［J］.Molecular Biotechnology，1999，12：35－73.

［4］ Coffman J A，Rai R，Cunningham T，et al.Gat1p，a GATA family protein whose production is sensitive to nitrogen catabolite repression，participates in transcriptional activation of nitrogencatabolicgenes in Saccharomyces cerevisiae ［J］.Molecular and Cellular Biology，1996，16：847－858.

［5］ Coffman J A，Rai R，Loprete D M，et al.Cross regulation of four GATA factors that control nitrogen catabolic gene expression in Saccharomyces cerevisiae ［J］.Journal of Bacteriology，1997，179：3416－3429.

［6］ Cooper T G.Transmitting the signal of excess nitrogen in Saccharomyces cerevisiae from the Tor proteins to the GATA factors：connecting the dots［J］.FEMS Microbiology Reviews，2002，26：223－238.

［7］ Courchesne W E，Magasanik B.Regulation of nitrogen assimilation in Saccharomyces cerevisiae：roles of the URE2and GLN3 genes［J］.Journal of Bacteriology，1988，170：708－713.

［8］ Cox K H，Rai R，Distler M，et al.Saccharomyces cerevisiae GATA sequences function as TATA elements during nitrogen catabolite repression and when Gln3p is excluded from the nucleus by overproduction of Ure2p［J］.Journal of Biological Chemistry，2000，275：17611－17618.

［9］ Cunningham T S，Andhare R，Cooper T G.Nitrogen catabolite repression of DAL80expression depends on the relative levels of Gat1p and Ure2p production in Saccharomyces cerevisiae［J］.Journal of Biological Chemistry，2000，275：14408－14414.

［10］ Cunningham T S，Cooper T G.Expression of the DAL80gene，whose product is homologous to the GATA factors and is a negative regulator of multiple nitrogen catabolic genes in Saccharomyces cerevisiae，is sensitive to nitrogen catabolite repression ［J］.Molecular and Cellular Biology，1991，11：6205－6215.

［11］ Cunningham T S，Cooper T G.The Saccharomyces cerevisiae DAL80repressor protein binds to multiple copies of GATAA－containing sequences（URSGATA）［J］.Journal of Bacteriology，1993，175：5851－5861.

［12］ Cunningham T S，Dorrington R A，Cooper T G.The UGA4 UASNTRsite required for GLN3－dependent transcriptional activation also mediates DAL80－responsive regulation and DAL80protein binding in Saccharomyces cerevisiae ［J］.Journal of Bacteriology，1994，176：4718－4725.

［13］ Cunningham T S，Rai R，Cooper T G.The level of DAL80expression down－regulates GATA factor－mediated transcription in Saccharomyces cerevisiae ［J］.Journal of Bacteriology，2000，182：6584－6591.

［14］ Deberardinis R J，Lum J J，Hatzivassiliou G，et al.The biology of cancer：metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation［J］.Cell Metabolism，2008，7：11－20.

［15］ Feller A，Boeckstaens M，Marini A M，et al.Transduction of the nitrogen signal activating Gln3－mediated transcription is independent of Npr1kinase and Rsp5－Bul1／2ubiquitin ligase in Saccharomyces cerevisiae ［J］.Journal of Biological Chemistry，2006，281：28546－28554.

［16］ Chi Z M，Li J F，Wang X H，et al.Inositol and phosphatidylinositol mediated glucose derepression，gene expression and invertase secretion in yeasts［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2004，36：443 449.

［17］ Yao S，Chi Z M，He S.Studies on inositol－mediated expression of MAL gene encoding maltase and phospholipid biosynthesis in Schizosaccharomyces pombe［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2006，33：417－422.

［18］ Yao S，Chi Z M，He S.Regulation of MAL1＋gene expression encoding maltase in Schizosaccharomyces pombe by added inositol［J］.Indian Journal of Biochemistry and Biophysics，2006，43：143－147

［19］ Chi Z，Ma L，Gao L，et al.Added inositol regulates invertase secretion and glucose－repressed SUC2gene expression in Saccharomyces sp.W4［J］.Indian Journal of Biochemistry and Biophysics，2007，44（3）：106－113.

［20］ Chi Z M，Ni X，Yao S.Cloning and overexpression of a maltase gene from Schizosaccharomyces pombe in Escherichia coli and characterization of the recombinant maltase ［J］.Mycol Res，2008，112：983－989.

［21］ Chi Z M，He S，Yao S.Effects of Pichia pastoris INO1expression in Schizosaccharomyces pombe on phosphatidylinositol（PI）synthesis and expression of INV＋encoding invertase ［J］.Enzyme and Microbial Technology，2005，37：395－401.

［22］ Chi Z M，Chi Z，Liu G，et al.Saccharomycopsis fibuligera and its applications in biotechnology ［J］.Biotechnology Advances，2009，27：423－431.

［23］ Cassart J P，Ostling J，Ronne H，et al.Comparative analysis in three fungi reveals structurally and functionally conserved regions in the Mig1repressor ［J］.Molecular and General Genetics，1997，255：9－18.

［24］ Liu G L，Wang D S，Wang L F，et al.Mig1is involved in mycelial formation and expression of the genes encoding extracellular enzymes in Saccharomycopsis fibuligera A11 ［J］.Fungal Genetics and Biology，2011，48：904－913.

［25］ Lachance M A.Kluyveromyces van der Walt em end.van der Walt［M］.Netherlands：Amsterdam，Elsevier，1998：227－247.

［26］ Llorente B，Malpertuy A，Blandin G，et al Genomic exploration of the hemiascomycetous yeasts，12.Kluyveromyces marxianus var.marxianus［J］.FEBS Letters，2000，487：71－75.

［27］ Lane M M，Morrissey J P.Kluyveromyces marxianus：A yeast emerging from its sister′s shadow ［J］.Fungal Biology Reviews，2010，24（2）：1－10.

［28］ Haas H.Molecular genetics of fungal siderophore biosynthesis and uptake：the role of siderophores in iron uptake and storage［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2003，62：316－330.

［29］ Hider R C，Kong X L.Chemistry and biology of siderophores［J］.Natural Product Reports，2010，27：637－657.

［30］ Scazzocchio C.The fungal GATA factors［J］.Current Opinion In Microbiology，2000，3（2）：126－131.

［31］ Harrison K A，Marzluf G A.Characterization of DNA binding and the cysteine rich region of SRE，a GATA factor in Neurospora crassa involved in siderophore synthesis ［J］.Biochemistry，2002，41：15288－15295.

［32］ An Z，Mei B，Yuan W M，et al.The distal GATA sequences of the sid1promoter of Ustilago maydis mediate iron repression of siderophore production and interact directly with Urbs1，a GATA family transcription factor［J］.EMBO Journal，1997，16：1742－1750.

［33］ Zhou L，Marzluf G A.Functional analysis of the two zinc fingers of SRE，a GATA－type factor that negatively regulates siderophore synthesis in Neurospora crassa ［J］.Biochemistry，1999，38：4335－4341.

［34］ Renshaw J C，Robson G D，Trinci A P J，et al.Fungal siderophores：structures，functions and applications［J］.Mycological Research，2002，106：1123－1142.

［35］ Oberegger H，Schoeser M，Zadra I，et al.SREA is involved in regulation of siderophore biosynthesis，utilization and uptake in Aspergillus nidulans［J］.Molecular Microbiology，2001，41：1077－1089.

［36］ Martins L J，Jensen L T，Simon J R，et al.Metalloregulation of FRE1and FRE2homologs in Saccharomyces cerevisiae ［J］.Journal of Biological Chemistry，1998，273：23716－23721.

［37］ Wang W，Chi Z，Liu G，et al.Chemical and biological characterization of siderophore produced by the marine－derived Aureobasidium pullulans HN6.2and its antibacterial activity ［J］.Biometals，2009，22：965－972.

［38］ Wang W L，Chi Z M，Chi Z，et al.Siderophore production by the marine－derived Aureobasidium pullulans and its antimicrobial activity［J］.Bioresource Technology，2009，100：2639－2641.

［39］ Chi Z，Wang X X，Ma Z C，et al.The unique role of siderophore in marine－derived Aureobasidium pullulans HN6.2 ［J］.Biometals，2012，25：219－230.

［40］ Johnston M，F(xiàn)lick J S，Pexton T.Multiple mechanisms provide rapid and stringent glucose repression of GAL gene expression in Saccharomyces cerevisiae ［J］.Molecular and Cellular Biology，1994，14，3834－3841.

［41］ Li J，Wang S，VanDusen W J，et al.Green fluorescent protein in Saccharomyces cerevisiae：real－time studies of the GAL1promoter［J］.Biotechnology and Bioengineering，2000，70：187－196.

［42］ Rohde J R，Trinh Sadowski.Multiple signals regulate GAL transcription in yeast［J］.Molecular and Cellular Biology，2000，20（11）：3880－3886.

［43］ Vodala S，Abruzzi K C，Rosbash M.The nuclear exosome and adenylation regulate posttranscriptional tethering of yeast GAL genes to the nuclear periphery ［J］.Molecular Cell，2008，31：104－113.

［44］ Luthra R，Kerr S C，Harreman M T，et al.Actively transcribed GAL genes can be physically linked to the nuclear pore by the SAGA chromatin modifying complex ［J］.Journal of Biological Chemistry，2007，282：3042－3049.

［45］ Kumar P R，Yu Y，Sternglanz R，et al.NADP regulates the yeast GAL induction system ［J］.Science，2008，319：1090－1092.