腫柄菊粗提物對線蟲毒殺活性的研究

張余杰，劉志華，張 亞，秦小萍，何金玲

（1.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南 昆明650201；2.河南省濮陽縣農(nóng)業(yè)局，河南 濮陽457100；3.湖南農(nóng)業(yè)大學生物安全科技學院，湖南 長沙410128）

腫柄菊（Tithonia diversifolia A.Gray），屬于菊科腫柄菊屬植物，又稱金光菊、樹菊，多年生半灌木狀草木植物，根系發(fā)達，莖粗壯，繁殖力強，能在各類土壤中生長[1］。原產(chǎn)地為墨西哥及中美洲地區(qū)，現(xiàn)大量分布于熱帶和亞熱帶，在東南亞、南非、太平洋的一些國家和地區(qū)成為入侵田間、路邊的雜草，逐漸擴散形成單一優(yōu)勢種群[2］。目前，腫柄菊在我國廣東、廣西、福建、云南等省有逃逸種群分布，尤其是環(huán)境適宜的云南省，已經(jīng)給該地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來一定危害，同時對生物多樣性造成了威脅，是一種具有較大潛在危害性的外來植物[3］。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是近些年來廣泛應用于毒理學研究的經(jīng)典模式動物[4，5］。秀麗隱桿線蟲繁殖速度快，在土壤和水中都能生存，十分有利于短期藥效試驗。

菊科植物化學成分的復雜性和多樣性均居植物界之首，潛在著大量的殺菌、殺蟲活性成分，具有極高的研究價值和廣闊的開發(fā)利用前景[6］。但國內(nèi)外對腫柄菊的研究并不多，主要集中在除草和殺蟲活性研究、藥物開發(fā)、有機肥料的利用等方面。郝妮娜等[7］研究表明腫柄菊提取物對7種病原菌具有抑制作用。楊海艷等[8］報道了腫柄菊對蜈蚣蕨孢子萌發(fā)和假根生長的影響。王麗等[9］研究表明腫柄菊水提液對水田稗和玉米種子萌發(fā)具有顯著的抑制作用。Jama等[10］報道腫柄菊作為綠肥不僅可以豐富作物營養(yǎng)物質(zhì)來源，而且可以降低土壤中某些物質(zhì)對磷元素的吸附并增加土壤微生物的量。Basamba等[11］研究表明腫柄菊可以顯著提高貧瘠土壤的交換性鈣、鎂、鉀等營養(yǎng)成分。Herrera等[12］從腫柄菊中分離出4種倍半萜烯內(nèi)酯類化合物。Macias等[13］對腫柄菊的研究為開發(fā)新作用靶點的除草劑和殺蟲劑提供了新思路。Adedire等[14］研究表明腫柄菊葉干粉乙醇提取物對四紋豆象有明顯的殺卵、抗成蟲羽化和殺蟲作用，具有開發(fā)為昆蟲殺蟲劑的潛力。周鴻等[15］報道了腫柄菊3種成分：圓葉腫柄菊素A、圓葉腫柄菊素C和3，5－二氧－咖啡?？崴幔渲锌Х弱？崴嵊幸欢ǖ目咕钚訹16］。Bordoloi等[17］研究表明腫柄菊含有的青蒿酸、青蒿素等可開發(fā)為天然的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，亦可以作為天然除草劑合成的模型物。

目前，有關腫柄菊提取物對線蟲的毒殺活性及其成分還缺乏研究，其毒殺線蟲的機制更是鮮有報道。作者在此考察腫柄菊的不同有機溶劑粗提物的毒殺線蟲活性（簡稱殺線活性），擬為研制高效低毒、綠色環(huán)保的新型殺線蟲農(nóng)藥奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料

腫柄菊（Tithonia diversifolia）采集于云南昆明跑馬山區(qū)域。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）由云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院農(nóng)藥系提供。用貝曼氏漏斗法分離出一定數(shù)量的線蟲，采用離心機清洗純化（1500r·min－1，5min）3次，加入適量蒸餾水，配制成每毫升含秀麗隱桿線蟲約7條的懸液（混合蟲齡），封口膜密封，備用。

1.2 試劑與儀器

石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇均為化學純，丙酮為分析純，實驗用水為蒸餾水。

BCD－215YD型冰箱，青島海爾股份有限公司；SHB－Ⅲ型真空泵、HH－S型水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HS.Z68.10型蒸餾水器，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SW－CJ－1FD型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；SZM系列體視顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；R205B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申生科技有限公司；FA2004型上皿電子天平，上海精科天平；8200H型超聲波清洗器，上?？茖С晝x器有限公司；FZ102型微型植物粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；RXZ型智能人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司；Finnpipette colour型單道移液器（20～200μL），芬蘭雷勃集團；TopPette型單道移液器（100～1000μL），大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司；YXQ.SG46.280型手提式壓力蒸汽滅菌器，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗提物的制備

1.3.1.1 石油醚／乙酸乙酯粗提物的制備

將采集的腫柄菊枝葉在自然條件下晾1～2d，然后置于45℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，用微型粉碎機粉碎后過40目篩。稱取一定量粉末放入三角瓶中，加入石油醚／乙酸乙酯浸泡24h，然后置于超聲波清洗器中振蕩30min。最后用濾紙過濾，所得濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮蒸干，即得到石油醚／乙酸乙酯粗提物，密封置于冰箱中冷藏，備用。

1.3.1.2 二氯甲烷粗提物的制備

將采集的腫柄菊枝葉在自然條件下晾1～2d，然后置于45℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，收集干枝葉600g，分裝于3個三角瓶中，然后加入適量二氯甲烷浸泡24h。所得浸泡液用濾紙過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮蒸干。將所得黃色提取物重新溶解在甲醇－水（7∶3）中，室溫下過夜，棄沉淀，所得上清液再次用石油醚（沸點40～60℃）萃取，蒸干，即得到二氯甲烷粗提物，密封置于冰箱中冷藏，備用。

1.3.2 毒殺線蟲實驗

采用藥液浸漬法[18］。用分析天平準確稱取一定量的粗提物，先加入一定量的丙酮（體積分數(shù)不超過5%）溶解，再加入適量蒸餾水，分別配制成10mg·mL－1、20mg·mL－1、40mg·mL－1共3個質(zhì)量濃度的藥液，封口膜封好，備用。取直徑6cm小玻璃培養(yǎng)皿若干，分別加入搖勻的線蟲懸液7mL，再加入3mL不同質(zhì)量濃度的藥液，每個處理做4組平行實驗。以丙酮溶液（丙酮＋蒸餾水）作為對照，丙酮的濃度與藥液中的丙酮濃度相同。最后將培養(yǎng)皿置于5℃、RH60%黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h用體視顯微鏡觀察3次，用針刺法確定線蟲死亡與否，記錄每次線蟲死亡的條數(shù)。

1.4 統(tǒng)計分析

各處理組的死亡率、校正死亡率按下式計算：

按文獻方法[19］將殺線活性分為五級：

“－”：表示校正死亡率≤10%，無殺線活性；

“＋”：表示校正死亡率為10%～30%，殺線活性弱；

“＋ ＋”：表示校正死亡率為30%～50%，殺線活性中等；

“＋ ＋ ＋”：表示校正死亡率為50%～80%，殺線活性較強；

“＋ ＋ ＋ ＋”：表示校正死亡率＞80%，殺線活性強。

2 結(jié)果與討論

2.1 腫柄菊不同粗提物的殺線活性（表1 ）

由表1 可知，乙酸乙酯和石油醚粗提物的殺線活性隨其濃度的增大逐漸提高，但二氯甲烷粗提物例外，其殺線活性在中等濃度時較高。濃度為10mg·mL－1時，3種粗提物均無殺線活性；濃度為20mg·mL－1時，殺線活性大小依次為二氯甲烷粗提物＞石油醚粗提物＞乙酸乙酯粗提物，二氯甲烷粗提物處理72h后，線蟲校正死亡率達到50.6%，而石油醚和乙酸乙酯粗提物處理72h后的線蟲校正死亡率分別為42.9%、33.3%；濃度為40mg·mL－1時，乙酸乙酯和石油醚粗提物處理48h后的殺線蟲效果已較好，處理72h后線蟲校正死亡率分別達到73.6%、70.8%，而二氯甲烷粗提物殺線活性較弱。總體而言，乙酸乙酯和石油醚粗提物的殺線活性較好。

表1 腫柄菊不同粗提物的殺線活性Tab.1 Poisonous activity on Caenorhabditis elegans of different Tithonia diversifolia crude extracts

2.2 討論

目前，化學藥劑仍是防治線蟲的主要手段，比較常用的殺線蟲劑為溴甲烷、克百威、噻唑磷等，存在持效長、污染嚴重等問題，與現(xiàn)代社會環(huán)保節(jié)約的發(fā)展理念相悖。隨著人類環(huán)保意識的加強，化學藥劑將會逐漸停止使用，研究、開發(fā)新型高效殺線蟲劑是線蟲防治發(fā)展的趨勢。20世紀80年代，許多國家開始了植物源殺線蟲劑的研究，其中美國、英國和印度對此方面研究較多，確定了很多植物活性成分的殺線活性，取得了較大的進展[20，21］。截止2009年，已經(jīng)報道具有殺線活性的植物約有100多種、40多科，其中具有殺線活性的天然化合物也達到10多類100多個[22，23］。

對腫柄菊3種不同有機溶劑粗提物的殺線活性分析表明，乙酸乙酯和石油醚粗提物殺線蟲效果較好，在生物防治線蟲方面具有廣闊的開發(fā)前景。本研究結(jié)果與龍鼎新等[24］開發(fā)的化學藥劑對松材線蟲的活性結(jié)果相比，存在一定差距，主要原因可能是：（1）本研究所使用的粗提物中有效殺線蟲活性成分的含量不高，分離純化后其殺線蟲效果可能會大大提高；（2）秀麗隱桿線蟲和松材線蟲雖然同屬于線形動物門線蟲綱，但在生理特性、生活習性等方面存在一些差異，一定程度上影響了實驗結(jié)果；（3）實驗過程中人為因素的影響。但本研究結(jié)果與禁用的劇毒農(nóng)藥甲胺磷相比，殺線蟲效果差異較小。翁群芳等[25］的研究也表明腫柄菊粗提物對松材線蟲的毒殺效果較好。

本研究只是對腫柄菊地上部分的粗提物進行了殺線活性研究，沒有進行盆栽試驗，未能深入研究有效殺線蟲活性成分在枝葉中含量的高低，也未對粗提物中有效成分進行分離和鑒定，這些將是下一步研究的重點和方向。

3 結(jié)論

腫柄菊不同溶劑的粗提物具有較好的毒殺線蟲活性，當濃度為10mg·mL－1時，石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷粗提物24～72h內(nèi)對線蟲的毒殺效果較弱；當濃度為20mg·mL－1時，二氯甲烷粗提物毒殺線蟲活性最好，處理72h的線蟲校正死亡率可達50.6%，乙酸乙酯粗提物和石油醚粗提物毒殺線蟲活性均較弱；當濃度為40mg·mL－1時，毒殺線蟲活性大小依次是乙酸乙酯粗提物＞石油醚粗提物＞二氯甲烷粗提物，其中乙酸乙酯粗提物處理72h的線蟲校正死亡率達73.6%。未來應結(jié)合多種技術手段，將不同溶劑粗提物中的活性物質(zhì)進行分離、純化，有望開發(fā)出高效低毒、綠色環(huán)保的新型殺線蟲農(nóng)藥。

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