黃嘌呤氧化還原酶鉬中心與配體的相互作用

王傳銘，張旭東，王 棟，謝 昆

（1.紅河學(xué)院云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制實驗室 云南蒙自 661100；2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 昆明 650091）

作為第6族(VIB族，鉻族)的過渡金屬，鉬(Molybdenum,Mo)是第二過渡系中唯一一種對地球上幾乎所有生命都不可或缺的元素[1].在哺乳動物體內(nèi)，鉬主要以鉬蝶呤(molybdopterin，MPT)的形式存在于黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase，XOR)等三類金屬酶中，并以其高的可變化合價參與到氧化還原過程之中.

XOR是廣泛分布于各種生物體內(nèi)調(diào)控核酸代謝過程的一種重要酶類，主要功能是催化嘌呤代謝的最后兩步，即次黃嘌呤氧化為黃嘌呤和黃嘌呤進一步氧化為尿酸.這些生化反應(yīng)在氮循環(huán)和能量代謝過程中具有重要作用，故有關(guān)此酶的結(jié)構(gòu)、功能和活性調(diào)控研究一直是生物醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點.本文試從結(jié)構(gòu)生物學(xué)和計算化學(xué)的角度對此酶的催化關(guān)鍵位點(鉬蝶呤中心)與其相應(yīng)配體(底物、抑制劑等)之間的相互作用形式方面的研究進展展開綜述，以期幫助人們了解其催化過程及酶活抑制的分子機理.

1 鉬碟呤中心的結(jié)構(gòu)與功能

截至2012年7月，PDB(Protein Data Bank)中已經(jīng)收錄了35個實驗測定的XOR結(jié)構(gòu)(表1).從這些解析的數(shù)據(jù)可以看出[2,3]，XOR催化位點包含三個氧化還原中心(redox centre)：一個鉬蝶呤輔因子、兩個Fe2S2中心和一個核黃素腺嘌呤二核苷酸輔因子(FAD)，三個部分幾乎呈線性排列(如圖1A).其中鉬蝶呤中心是XOR催化關(guān)鍵位點，使體內(nèi)的黃嘌呤成為尿酸，在此過程中鉬中心首先失去2個電子(由六價成為四價)，經(jīng)鐵硫中心傳遞，然后通過FAD將電子傳給NAD+或氧分子，將其轉(zhuǎn)化成NADH或.

圖1 A：XOR的三個輔因子的空間位置關(guān)系(以PDB:3UNC為例) B：鉬蝶嶺輔因子的簡化模型

在理論模擬中，鉬輔因子中的蝶呤部分常以不同形式簡化以減少計算量，其中吡喃環(huán)和吡嗪環(huán)在模擬中可以提供足夠的信息，相比之下蝶呤部分遠離鉬原子的第二個環(huán)可以略去，對計算可靠性影響不大[4].最簡化的方式是只保留兩個與鉬原子配位結(jié)合的硫原子及其相連的兩個碳原子(圖1B).催化關(guān)鍵部位是一個以鉬為中心原子的四角錐形配位結(jié)構(gòu)，其具體配位方式人們還存在不同看法理解.相對統(tǒng)一的理解是：四角錐頂端是氧原子(Mo=Oap)，底部四邊形的三個端點分別是兩個與蝶嶺亞基結(jié)合的硫原子(S-Mo)和一個羥基(Mo-OH).而第四個頂點(Xeq)可能有硫(Mo=Seq)和氧(Mo=Oeq)兩種情況.Mo=Seq方式是有活性的結(jié)構(gòu)，也是目前公認的XOR家族的模式特征，被廣泛應(yīng)用在絕大多數(shù)理論計算中[5-7].而Mo=Oeq結(jié)構(gòu)沒有活性，并且在此種結(jié)構(gòu)中用Sap替換Oap后XOR的活性仍然無法恢復(fù)[8,9].但最近也有證據(jù)顯示，作為一種鉬蝶嶺的可變結(jié)構(gòu)，Mo=Oeq方式也有其功能[10,11].此外，作為XOR家族的另一成員，乙醛氧化還原酶的鉬中心四角錐頂端不是氧原子而是硫原子.

表1 PDB數(shù)據(jù)庫中收錄的黃嘌呤氧化還原酶結(jié)構(gòu)信息(截至2012年7月)

2 鉬碟呤中心與底物的相互作用

2.1 黃嘌呤生成尿酸的反應(yīng)循環(huán)途徑

圖2顯示了黃嘌呤在鉬中心催化下生成尿酸的兩種不同的反應(yīng)機制[12].第一種反應(yīng)路徑依次是圖中A-B-C-D-E-F-A，即：黃嘌呤中咪唑環(huán)上的氮原子首先與鉬原子發(fā)生相互作用而靠近(B)，隨后咪唑環(huán)上的碳原子與鉬成鍵(Mo-C方式)，該碳原子上的氫原子轉(zhuǎn)移到鉬中心的硫基上，Mo-C鍵和S-H鍵的形成同步發(fā)生(C)，屬于協(xié)同(concerted)反應(yīng).來自去質(zhì)子化水分子或Mo-OH上的羥基進攻底物上這個被激活的碳(D)，生成Mo(IV)中間體(E).鉬失去一個電子和一個質(zhì)子(傳遞給FAD)后形成F.

圖2 兩條不同的黃嘌呤氧化還原酶催化反應(yīng)循環(huán)途徑

近年來人們又提出來另一種反應(yīng)路徑(圖中的A-G-H-E-F-A)，即帶有活性羥基的鉬中心(G)直接進攻底物上碳原子(Mo-O方式)，經(jīng)過一個中間體(H)或直接一步反應(yīng)生成E.這兩種方式中哪一種更符合真實情況，人們還在不斷驗證中.

2.2 有關(guān)鉬中心與底物作用的量化計算和QM/MM研究

最初人們多采用AM1等半經(jīng)驗方法對XOR的反應(yīng)機制進行量子化學(xué)計算[13]，密度泛函方法(DFT)應(yīng)用在此方面始自1997年[14].理論模型中的簡化底物有甲醛、乙醛、甲酰胺、黃嘌呤和次黃嘌呤等[15-18].以黃嘌呤為底物的計算只設(shè)想了一種協(xié)同反應(yīng)機制[7]，以其他較小分子為底物的計算則多給出了協(xié)同和分步(stepwise)兩種機制(圖3).分步方式中第一步反應(yīng)的勢壘(約17.8kcal mol-1)一般高于協(xié)同機制(約11.9kcal mol-1)[19].UMP2理論方法計算出的勢壘遠高于此[20].

氧化還原反應(yīng)的本質(zhì)是電子的得失，生物體內(nèi)的氧化還原酶的主要功能就是通過特定的化學(xué)反應(yīng)在底物分子上添加或移去電子.雖然此功能多是通過酶的輔因子(包括各種輔酶、輔基和金屬離子等)參與完成，但組成酶的氨基酸殘基在穩(wěn)定輔因子、識別和穩(wěn)定配體等方面也具有重要作用.因此，如果把XOR活性位點附近的氨基酸殘基的作用也考慮進去，則鉬中心催化底物反應(yīng)的過程更加復(fù)雜，相應(yīng)的理論模擬計算量會急劇增加.因此能夠平衡計算效果和計算量的QM/MM方法越來越多地應(yīng)用在XOR的理論研究中[21,22].鉬蝶呤復(fù)合物與酶本身并無直接的鍵鍵作用，維系二者之間穩(wěn)定位置關(guān)系的主要作用是氫鍵(如圖4).這種以氫鍵為主的分子間非共價聯(lián)系也是底物與酶之間十分重要的相互作用形式.圖5就列出了黃嘌呤底物在與鉬中心反應(yīng)時可能具有的兩種不同的分子取向，分別是美國學(xué)者R.Hille提出的“upside”(圖5B)方式和日本學(xué)者T.Nishino提出的“upside down”(圖5A)方式[23].在這兩種底物取向中，相互作用的氨基酸殘基也不盡相同.精氨酸(Arg880)上帶正電的胍基通過靜電相互作用穩(wěn)定了底物在反應(yīng)中間體中與酶的結(jié)合強度，在上述兩種取向方式中都具有重要作用.第802位的谷氨酸(Glu802)的作用相對較小，因為實驗觀察到其突變?yōu)楣劝滨０?Gln802)后，酶活性降低但并未完全消失；而相應(yīng)的理論計算顯示，此時的底物仍以“upside down”取向與突變體結(jié)合，

圖3 量子化學(xué)計算的黃嘌呤氧化還原酶的兩種催化反應(yīng)機制

圖4 鉬蝶呤中心與活性位點附近的氨基酸殘基相互作用示意圖(以PDB：1FO4為例)

圖5 日本學(xué)者Yamaguchi等(A)和美國學(xué)者Pauff等(B)根據(jù)理論計算推測的黃嘌呤底物的兩種不同的結(jié)合模式(圖中氨基酸序號來自大鼠)

只是氫鍵方式發(fā)生了一些改變.2010年T.Nishino又專門通過測定尿酸結(jié)合狀態(tài)下的XOR的晶體結(jié)構(gòu)進一步對這兩種黃嘌呤結(jié)合取向進行了實驗驗證[24].

3 鉬碟呤中心與抑制劑的相互作用

XOR催化過程中產(chǎn)生的活性氧可參與體內(nèi)多種生理(如牛乳中富含的XOR使其具有較強的抗菌性[25])和病理(如腫瘤、心血管疾病等)過程.此外，XOR的活性如果異常，會導(dǎo)致體內(nèi)嘌呤代謝產(chǎn)生的尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)和軟組織而引發(fā)痛風(fēng)(gout).由于痛風(fēng)發(fā)病率在以往幾十年間都比較低，對XOR抑制劑的研究因而也相對滯后.臨床治療痛風(fēng)的藥物品種極少(截至目前只有2種獲批上市)，且副作用和不良反應(yīng)多(如苯溴馬隆因潛在的肝毒性已被美國FDA禁止用于痛風(fēng)治療).近年來由于人們生活水平逐步提高，痛風(fēng)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，成為當今世界中老年常見疾病，被聯(lián)合國列為21世紀二十大頑癥之一，研究開發(fā)天然低毒高效的新型XOR抑制劑具有廣闊的市場前景[26].

最早發(fā)現(xiàn)的XOR抑制劑主要是嘌呤類類似物，包括鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤類似物等，它們與底物結(jié)構(gòu)相似，能競爭性地與酶的結(jié)合，從而抑制底物與酶的作用.然而，這些抑制劑與體內(nèi)其他多種酶的底物也類似，從而會影響到其他酶的功能或經(jīng)其他酶作用生成毒性代謝產(chǎn)物，限制了該類藥物的使用.故1966年以來，臨床許可使用的嘌呤類XOR抑制劑僅有別嘌呤醇(allopurinol)一種，雖已上市近半個世紀，至今仍一直在使用.其在體內(nèi)快速羥化而生成的代謝產(chǎn)物奧西嘌呤(氧化別嘌呤醇，oxypurinol，III期臨床階段)雖抑制活性更強，但其與鉬中心的結(jié)合是不可逆的Mo-N共價方式(圖6A)，因而發(fā)現(xiàn)新型非嘌呤類、高效、安全的黃嘌呤氧化酶抑制劑顯得十分必要而緊迫.

近年來不少學(xué)者已經(jīng)陸續(xù)研究發(fā)現(xiàn)了一些活性較好的非嘌呤類抑制劑[3,27-30]，其中Febuxostat已于2009年由日本武田制藥公司生產(chǎn)上市，成為1966年以來FDA批準的第二個抗痛風(fēng)新藥[28].所有這些抑制劑的作用機制各不相同(表2)，與底物類似的嘌呤類等化合物對XO產(chǎn)生的多是競爭性(competitive)抑制作用，其他類型化合物對酶的作用則有競爭性、非競爭性(noncompetitive)以及混合型抑制等各種各樣不同的類型，此外還存在少量的反競爭性(uncompetitive)抑制類型.競爭性的抑制劑作用位點一般都是底物結(jié)合位點(如圖6B)，酶不能同時與底物和抑制劑結(jié)合；非競爭性抑制劑和底物分別在酶的不同結(jié)構(gòu)區(qū)域結(jié)合，結(jié)合沒有先后順序之分.而XOR的反競爭抑制劑只能與酶與底物的復(fù)合物發(fā)生相互作用，即酶結(jié)合上底物之后才能與抑制劑結(jié)合，人們對這類抑制劑的確切結(jié)合位點還不十分清楚.

圖6 兩種抑制劑與XOR活性位點之間的作用方式.A:氧化別嘌呤醇 B:FYX-051

在哺乳動物體內(nèi)，XOR有兩種可相互轉(zhuǎn)化的形式即黃嘌呤脫氫酶(xanthenes dehydrogenase，XDH)及黃嘌呤氧化酶(xanthine oxygenase，XO)，二者基因序列相同，F(xiàn)e/S中心和Mo-pt中心的結(jié)構(gòu)也無甚差別，只是FAD周圍的氨基酸側(cè)鏈發(fā)生移動，遮蓋了NAD+通向FAD的通道(圖7)，但仍可以允許相對較小的氧分子進入，因此XDH電子傳遞途徑的最終受體是NAD+，而XO電子傳遞的最終受體是氧分子[31,32].

圖7 XOR的兩種形式中FAD位點附近的結(jié)構(gòu)差別.A: XDH (PDB:1FO4) B:XO (PDB:1FIQ)

表2 黃嘌呤氧化還原酶抑制劑

有確鑿的實驗結(jié)果證明，XO催化反應(yīng)類似ping-pong機制[33]，即第一種底物黃嘌呤先結(jié)合到酶的鉬中心位點上，使酶構(gòu)型瞬間發(fā)生改變，并釋放出第一種產(chǎn)物尿酸，之后電子受體氧分子才結(jié)合到酶的FAD位點上并釋放第二種產(chǎn)物雙氧水，同時釋放出酶，從而開始下一輪催化.氧分子的這種結(jié)合方式在表現(xiàn)形式上非常類似反競爭性抑制劑.據(jù)此我們推測反競爭性抑制劑與XOR的結(jié)合方式：一種可能類似氧分子，結(jié)合在變構(gòu)后的FAD位點附近，阻斷電子受體的進入，從而發(fā)揮抑制活性；另一種是直接和鉬碟呤-黃嘌呤復(fù)合體結(jié)合，阻止尿酸的生成和釋放.我們希望未來能通過一系列的實驗驗證和構(gòu)效關(guān)系分析去逐步探索這個問題.

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