櫛江珧精子超微結構的電鏡觀察

顧向飛, 邊平江, 周小龍, 林志華, 董迎輝

(1. 寧波大學 海洋學院, 浙江 寧波 315211; 2. 浙江萬里學院 浙江省水產種質資源有效利用技術研究重點實驗室, 浙江 寧波 315100; 3. 浙江省海洋水產養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005)

櫛江珧(Atrina pectinata), 又名江珧蛤、牛角江珧蛤、牛角蚶等, 隸屬于軟體動物門(Mollusca)瓣鰓綱(Lamellibranchia)貽貝目(Mytiloida)江珧科(Pinnidae)江珧屬(Atrina)[1]。櫛江珧廣泛分布于溫、熱帶泥砂質的近海區(qū)域, 屬于廣溫、廣鹽性的海產經濟貝類, 主要分布于我國的福建、廣東等沿海省份,在北方的山東、遼寧等海區(qū)也有分布[2]。櫛江珧具有較高的食用價值, 是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ暮ＫB(yǎng)殖種類。

近年來, 關于櫛江珧人工繁育和繁殖生物學方面的研究已見諸報道, 如開展了親貝人工促熟、稚貝附著基的選擇[3-4]以及雌核發(fā)育單倍體誘導[5]等人工繁育研究, 進行了生殖細胞發(fā)生的研究[6-7]、受精過程的細胞學觀察[8]、精子超低溫冷凍保存以及精子線粒體熒光活性檢查[9-10]等繁殖生物學研究。但是, 尚未見到關于櫛江珧精子超微結構的研究報道。本研究利用透射電鏡技術對櫛江珧精子的超微結構進行了觀察, 旨在為物種鑒定、生殖進化及受精機理研究提供細胞學依據。

1 材料方法

1.1 實驗材料

櫛江珧于2012年4月取自廣東湛江東海島自然海區(qū), 貝齡2～3 a, 殼長20～25 cm, 于寧波甬盛水產種業(yè)有限公司暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間混合喂養(yǎng)微綠球藻(Nannochloropsis oculata)、亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、牟氏角毛藻(Chaetoceros miielleri),以促進性腺發(fā)育。

1.2 精巢取樣及透射電鏡觀察

櫛江珧暫養(yǎng)2周后, 隨機抽取雄性個體, 活體解剖取精巢, 切成小塊, 用4℃ 2.5%戊二醛和1%鋨酸雙固定, 4℃冷藏保存。固定樣品經0.1 mol/dm3磷酸緩沖液漂洗, 30%～90%梯度乙醇脫水, 90%丙酮置換,無水丙酮脫水, Epon 812環(huán)氧樹脂包埋, 在日立H-7650透射電鏡下對精巢樣品切片進行觀察并拍照。

2 櫛江珧精子超微結構電鏡觀察結果

櫛江珧精子形態(tài)為近圓形, 屬于鞭毛型。成熟的精子由頭部、中段和尾部3部分構成。頭部長度約3 μm, 包括頂體(acrosome)和細胞核(nucleus)(圖1a)。中段則由中心粒復合體(centriolar complex)和線粒體(mitochondria)構成。尾部為鞭毛型。

圖1 櫛江珧精子的超微結構Fig. 1 Ultrastructure of spermatozoon in Atrina pectinata

2.1 頂體

頂體位于精子頭部最前端, 在透射電鏡下可觀察到頂體明顯突出。頂體縱切面呈倒“V”形, 在精子縱切面中軸方向上, 頂體長度約 0.7 μm, 占精子頭部長度的 1/5。頂體物質外包被一層膜, 根據其位置可分為頂體內膜(inner acrosomal membrane)和頂體外膜(outer acrosomal membrane), 二者圍成頂體腔(acrosomal space)(圖1b), 腔內頂體物質分布不均勻,靠近頂體外膜的為電子密度較大的弧狀帶。頂體外膜與質膜之間存在一薄層胞質, 頂體內膜與細胞核形成亞頂體腔(subacrosomal space)(圖1b、圖1c), 腔內亞頂體物質電子密度均勻且較低。

2.2 細胞核

頂體后部緊接著細胞核, 細胞核呈近球形, 直徑約 2.0 μm, 長度約 1.7 μm, 占精子頭部體積的大部分(圖1d)。細胞核是一個電子致密區(qū)域, 內含有高度濃縮的染色質, 同時可觀察到不規(guī)則染色較淺的核泡(nuclear vacuole)存在(圖1a)。細胞核前端略凹陷, 形成核前窩; 無核后窩; 在后端與線粒體相鄰處, 細胞核向內凹陷形成植入窩(implantation fossa)(圖1e、圖1f), 線粒體嵌于植入窩內。

2.3 中段

中段位于頭部和鞭毛之間, 由中央的中心粒復合體和呈輻射狀排列的線粒體構成。中心粒復合體由近端中心粒(proximal centriole)和遠端中心粒(distal centriole)構成(圖1e), 兩個中心粒均為圓柱狀,由9組微管組成。遠端中心粒是鞭毛的基體, 在末端發(fā)出鞭毛, 其長軸與精子的長軸方向一致, 近端中心粒則與遠端中心粒互相垂直。中段橫切面可以觀察到5個線粒體(圖1f)。線粒體嵌入細胞核的植入窩,為近橢圓形或球形, 長軸約0.3 μm, 短軸約0.2 μm。線粒體電子密度均勻且較低, 由內外兩層膜組成,內膜向腔內折疊形成線粒體嵴。

2.4 尾部

精子的尾部為鞭毛型, 橫切面呈圓形, 直徑約0.25 μm, 內部為軸絲(axoneme), 外部包被的質膜(plasma membrane)呈波浪狀(圖1g、圖1h)。軸絲由遠端中心粒末端發(fā)出, 起始端無中央微管, 為外周的9組二聯微管結構, 起始端之后為典型的“9+2”型結構。

3 討論

頂體是位于細胞核與質膜之間的囊狀細胞器,是一種特化的溶酶體, 含有多種水解酶類, 如透明質酸酶、酸性磷酸酶、蛋白水解酶等, 能夠溶解卵細胞的外被及濾泡細胞, 產生孔道, 使精子進入卵細胞[11]。 頂體酶作為受精過程中的關鍵酶, 在精子穿透卵膜時起溶解卵膜的作用, 對于營體外受精的貝類是十分重要的, 因而頂體酶活性高低可直接影響受精[12]。而對于褶紋冠蚌(Cristaria plicata)[13]、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)[14]等受精過程發(fā)生在雌貝外鰓腔內的淡水蚌類而言, 受精環(huán)境相對穩(wěn)定的, 并且卵的膠質卵膜較薄, 精子無需發(fā)達的頂體就可入卵, 因此這些貝類精子頂體通常體積較小, 結構簡單[15]。頂體腔內電子密度反映腔內的物質組成, 簾文蛤(Meretrix lyrata)[15]、西施舌(Coelomactra antiquata)[16]、溝紋巴非蛤(Paphia exarata)[17]等基部靠近核的位置電子密度較高; 而櫛江珧與文蛤(Meretrixmeretrix)[18]、 彩虹明 櫻 蛤(Moerella iridescens)[19]、翡翠貽貝(Perna viridis)[20]、合浦珠母貝(Pinctada martensi)[21]等類似, 靠近頂體外膜內側的位置電子密度較高, 推測腔內電子密度反映腔內頂體酶的分布。櫛江珧精子頂體結構為明顯的倒“V”字形, 且頂體約占整個頭部的 1/3, 頂體腔及亞頂體腔內含有電子密度不同的酶, 這與其生存的海水環(huán)境及體外受精機制是相適應的。

貝類精子結構在不同種屬間存在差異, 對于貝類系統分類具有重要意義[22]。多數雙殼貝類精子的細胞核為卵圓形, 如溝紋巴非蛤[23]、墨西哥灣扇貝(Argopecten irradians concentricus)[24]; 少數貝類精子的細胞核為圓柱形, 如櫛孔扇貝(Chlamys farreri)[25]、蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)[26]等: 還有一些貝類精子的細胞核近圓錐形, 如菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)[27]、斧文蛤(Meretrix lamarkii)[28]等; 但也存在特殊形態(tài)的細胞核, 如彩虹明櫻蛤的細胞核為螺旋狀[19]。櫛江珧精子的細胞核為近球形, 生物細胞的結構形狀與功能是相統一的,精子細胞核的形狀在一定程度上適應其在水中的運動以及穿透卵膜的能力, 從而提高受精的成功率。

核前窩是頂體絲突起的重要結構基礎, 而核后窩是精子尾部鞭毛形成的結構基礎; 核前窩的存在使得精子可以容納更多的亞頂體腔物質, 增加受精成功率[29]。精子細胞核的核前窩的有無在科內較為接近但存在差異, 如蚶科的毛蚶(Scapharca subcrenata)[29]、泥蚶(Tegillarca granosa)[30]及魁蚶(Scapharca broughtonii)[31]的精子細胞核形狀接近, 均為有核后窩而無核前窩, 但同科的青蚶(Barbatia virescens)[23]的細胞核則具有核前窩及核后窩。核前窩、核后窩的有無并不能作為判別物種間親緣關系的依據, 仍需引入其他可度量指標[15]。櫛江珧精子具有核前窩, 使得其精子具有較大的亞頂體腔, 以容納一些亞頂體腔物質, 雖不具有核后窩, 但具有完整的中心粒復合體, 具有完整的尾部結構, 有助于其在海水中游動及穿透卵膜完成受精。

線粒體切面通常呈卵圓形, 是由內外兩層彼此平行的單位膜套疊而形成的封閉的囊狀結構, 內膜向內折疊形成嵴, 嵴上分布有大量的呼吸鏈酶系及ATP 酶復合體, 可為精子運動和入卵過程提供能量[11]。同種雙殼貝類精子線粒體數目通常一致, 不同種類精子線粒體數目會有細微不同。通過比較雙殼貝類精子超微結構, 發(fā)現絕大多數精子線粒體數目為 4～5 個, 偶見 6 個[18]; 而本研究通過觀察精子中段橫截面, 發(fā)現櫛江珧具有5個線粒體, 沒有發(fā)現4個或者6個的情況, 故可以推斷櫛江珧精子線粒體數目較為穩(wěn)定。根據細胞代謝的需要, 線粒體在細胞質中可以進行運動、融合或者分裂增殖[11]。根據精子發(fā)生過程的研究可知, 線粒體的數目及位置在精細胞的早期就基本確定, 但在精子發(fā)生過程中存在著小個體線粒體融合成為個體較大線粒體的現象,據此雙殼貝類中成熟精子線粒體數目不一致是因為線粒體融合出現偏差。

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