粵東養(yǎng)殖區(qū)分離的2株海洋弧菌及其胞外產(chǎn)物對皺紋盤鮑致死毒性的初步分析

房沙沙, 林壯炳, 邱 礽, 王劭雯, 劉 曉

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東青島266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京100039; 3. 廣東省汕頭市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心站, 廣東汕頭515041)

皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)自然分布于我國遼東和山東半島水域[1], 是重要的海水養(yǎng)殖貝類。我國從20世紀80年代中期開始皺紋盤鮑人工養(yǎng)殖,主要養(yǎng)殖區(qū)在遼東半島、山東半島及福建北部和中部沿海。近30年來, 皺紋盤鮑養(yǎng)殖區(qū)域和規(guī)模增長迅速, 目前, 遼寧、山東、浙江、福建、廣東等省沿海海域均有皺紋盤鮑養(yǎng)殖。

2011年秋季以來, 福建和廣東東部養(yǎng)殖的皺紋盤鮑發(fā)生流行性病害, 培育的鮑苗死亡情況尤其嚴重。2011年12月初, 我們從廣東汕頭市南弘海珍養(yǎng)殖有限公司采集 2月齡患病幼鮑, 從中分離純化得到兩株細菌, 菌株編號分別為bb3和bb4, 回歸感染實驗表明, 菌株bb3和bb4均可致皺紋盤鮑死亡且可從接種死亡的受試鮑中重新分離得到。經(jīng)16S rRNA序列分析初步鑒定此 2株細菌均為弧菌; 經(jīng) topA,ftsZ, gapA, mreB, gyrB, pyrH, recA等管家基因的序列分析進一步明確 bb3為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), bb4為哈氏弧菌(V. harveyi)[2]。

為明確溶藻弧菌bb3、哈氏弧菌bb4與我國南方皺紋盤鮑流行性病害的關(guān)系, 我們開展了一系列的研究工作。本文報道該 2株弧菌及其胞外產(chǎn)物對皺紋盤鮑的致死效應(yīng)、侵染途徑及對抗生素的敏感性等研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 弧菌菌株

本研究使用的2株弧菌于2011年12月從汕頭市南弘海珍養(yǎng)殖有限公司的 2月齡患病幼鮑中分離得到, 菌株bb3為溶藻弧菌、bb4為哈氏弧菌[2]。

1.1.2 實驗動物

供試實驗動物為我們培育的皺紋盤鮑“97”選育群體第5代。2011年4月24日在榮成億祥水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司鮑育苗室繁育, 10月將部分苗種送到青島潤海海珍品養(yǎng)殖公司的鮑越冬車間養(yǎng)殖。越冬期間水溫 10～15℃, 投喂人工配合餌料, 日常管理按常規(guī)生產(chǎn)方法進行。2012年 3月, 供試幼鮑轉(zhuǎn)移到中國科學(xué)院海洋研究所培育樓暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間, 培育水溫20℃, 投喂鹽漬海帶, 每天清理糞便、殘餌并全量換水1次。

2012年4月, 從暫養(yǎng)的幼鮑中取3種規(guī)格個體用于本研究, 其中A組(殼長35.5 mm±0.9 mm、全濕重 5.58 g±0.48 g)和 C 組(殼長 24.5 mm±0.8 mm、全濕重1.84 g±0.11 g)用于比較幼鮑對弧菌的敏感性差異; 其他實驗均采用B組(殼長31.2 mm±1.4 mm、全濕重 4.01 g±0.54 g)幼鮑。

侵染實驗之前, 按實驗設(shè)計要求選取所需幼鮑,隨機分組備用。侵染處理結(jié)束后, 繼續(xù)在 20℃自然海水中培育, 每天2次清理、統(tǒng)計死亡幼鮑。

1.2 侵染實驗

1.2.1 弧菌懸浮液及胞外產(chǎn)物粗提液制備

弧菌懸液制備: 從LB平板上挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中, 在28℃, 160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)10～12 h后離心收集細菌, 用無菌PBS洗滌5遍。用PBS懸浮后在600 nm波長下測定細菌懸浮液的OD值(A), 按預(yù)實驗稀釋平板計數(shù)法標定的每 1.0 OD懸浮液的弧菌濃度[2](bb3: 12.4×108cfu/mL; bb4:10.0×108cfu/mL)調(diào)整到侵染實驗所需濃度?；【鷳乙褐苽浜罅⒓催M行注射處理。

胞外產(chǎn)物粗提液制備: 參考文獻[3-4]的方法略有改動, 在LB固體培養(yǎng)基表面覆蓋1層無菌玻璃紙,取100 μL供試菌的菌液均勻涂布于滅菌玻璃紙上培養(yǎng)過夜, 每個菌株鋪4～5個平板。每個平板用2 mL PBS洗下玻璃紙上生長的弧菌, 小心轉(zhuǎn)移到無菌離心管中, 于4℃、8 500 r/min離心30 min, 取上清, 經(jīng)孔徑0.22 μm的纖維素膜過濾, 所得濾液即為相應(yīng)菌株的胞外產(chǎn)物粗提液。

1.2.2 弧菌對皺紋盤鮑的致死效應(yīng)研究

弧菌及其胞外產(chǎn)物的侵染實驗在中國科學(xué)院海洋研究所培育樓進行。侵染實驗共采用注射、創(chuàng)傷-浸浴和取食等3種方法。侵染實驗全程在20℃進行,期間投喂餌料、清理糞便、換水等均采用常規(guī)方法。

注射: 本研究供試幼鮑及注射用弧菌懸液的濃度如表1所示。幼鮑陰干10～15 min后往每個供試幼鮑腹足中部的肌肉組織注射100 μL當天制備的弧菌懸浮液, 對照組注射相同體積的 PBS溶液。每個幼鮑的注射位置、深度基本接近。注射處理后約10 min,將受試幼鮑置于自然海水中培育。每處理3次重復(fù),每個重復(fù)各注射30個幼鮑。

表1 注射侵染的分組和處理情況Tab.1 The infection experiment by intramuscular injection

創(chuàng)傷-浸浴:(1)創(chuàng)傷-浸浴處理組: 用1 mL一次性無菌注射器的針頭刺入供試幼鮑的腹足部, 深度約2 mm, 每個供試鮑處理2次, 經(jīng)創(chuàng)傷處理后, 將幼鮑放入到弧菌濃度為1.0×108cfu/mL的海水中再進行浸浴處理, 24 h后轉(zhuǎn)移到自然海水中培育; (2)浸浴處理組: 未經(jīng)創(chuàng)傷處理的幼鮑在含弧菌1.0×108cfu/mL的海水中浸浴處理24 h后轉(zhuǎn)移到自然海水中培育;(3)創(chuàng)傷對照組: 經(jīng)過創(chuàng)傷處理的幼鮑直接置于自然海水中培育。每處理3次重復(fù), 每個重復(fù)各30個幼鮑。

取食: 實驗開始前在供試的健康幼鮑貝殼上做標記并對供試鮑進行為期2 d的饑餓處理。然后將注射 bb4懸液后死亡的幼鮑尸體投入到受試健康鮑的養(yǎng)殖容器中, 12 h內(nèi)將病死鮑尸從養(yǎng)殖容器中移除, 更換新鮮海水后再投入新的剛死亡的幼鮑尸體。實驗共進行5 d, 實驗期間不投喂其他餌料。觀察、記錄受試健康鮑對病死幼鮑軟體部的取食情況并每天2次觀察記錄取食者的死亡現(xiàn)象, 連續(xù)觀察1周。每組實驗含健康鮑和注射弧菌后死亡的一齡鮑各10個。

1.2.3 弧菌胞外產(chǎn)物粗提液致死毒性的初步研究

為研究供試菌胞外產(chǎn)物的致死毒性, 將胞外產(chǎn)物粗提液分別注射到供試幼鮑腹足部肌肉組織。每處理10個個體, 每組2次重復(fù), 對照組注射PBS溶液。注射處理后按常規(guī)方法管理, 每天2次觀察統(tǒng)計死亡個體數(shù)。

1.3 供試弧菌的藥敏試驗

選取20種抗生素, 采用紙片法進行藥敏試驗。藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。在每個LB固體培養(yǎng)基平板上涂布100 μL 濃度為5.0×108cfu/mL的菌液, 然后將藥敏紙片平鋪到培養(yǎng)基表面, 每個培養(yǎng)皿放置4片藥敏紙片。在28℃培養(yǎng)16 h后測定抑菌圈直徑, 依據(jù)生產(chǎn)廠家提供的判定標準(http://www.hangwei-media.com/tech1.asp )給出供試菌株對不同抗生素的敏感性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

某組幼鮑在統(tǒng)計時段內(nèi)的死亡個體數(shù)之和占該組供試鮑總數(shù)的百分比即為該組的累積死亡率, 相同處理的不同重復(fù)組之間的平均值即為該處理組的累積死亡率。采用SPSS16.0軟件中的T檢驗和單因素方差分析檢驗各處理間的差異顯著性, 顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 供試弧菌注射致死的劑量效應(yīng)關(guān)系

取100 μL不同濃度的弧菌懸液注射處理一齡皺紋盤鮑, 受試鮑的累積死亡率如圖1所示。由圖1可見, 受試鮑的累積死亡率隨注射弧菌菌液濃度的增加而升高, 且受試鮑的死亡集中出現(xiàn)在注射處理后的前 8 d, 之后逐漸趨穩(wěn), 2周后未見出現(xiàn)新的死亡(數(shù)據(jù)未列)。注射濃度為 2.5×106、2.5×107、2.5×108cfu/mL的 bb3菌液后, 第14天皺紋盤鮑的累積死亡率分別是 13.95%、43.33%、78.33%; 注射濃度為2.0×106、2.0×107、2.0×108cfu/mL 的 bb4菌液后, 第 14天皺紋盤鮑的累積死亡率分別是64.04%、78.02%、94.37%; 在本研究觀察的 2周內(nèi)對照組的平均累積死亡率為3.33%。上述結(jié)果表明, 溶藻弧菌bb3和哈氏弧菌bb4對皺紋盤鮑均有致死效應(yīng), 哈氏弧菌bb4的致死毒性強于溶藻弧菌bb3。

2.2 不同規(guī)格皺紋盤鮑對溶藻弧菌 bb3和哈氏弧菌bb4的敏感性差異

對不同規(guī)格皺紋盤鮑分別注射 100 μL濃度為2.5×107cfu/mL的溶藻弧菌bb3或2.0×107cfu/mL的哈氏弧菌bb4懸浮液, 其中A組平均殼長35.5 mm±0.9 mm、全濕重5.58 g±0.48 g, 為大規(guī)格組; C組平均殼長24.5 mm±0.8 mm、全濕重1.84 g±0.11 g, 為小規(guī)格組。注射處理2周后統(tǒng)計的各組累積死亡率見圖2。溶藻弧菌bb3侵染處理后, A組幼鮑的累積死亡率為20.00%, C組為58.89%, T檢驗結(jié)果顯示A組與C組的死亡率差異顯著(P＜0.05); 哈氏弧菌 bb4侵染處理后, A、C組受試鮑在2周時的累積死亡率分別為35.56%和 71.11%, 差異顯著(P＜0.05)。本研究的結(jié)果表明, 受試鮑對病原弧菌的敏感性與個體規(guī)格相關(guān), 體重小者對病原弧菌更敏感。因此, 我們在后續(xù)有關(guān)病原-宿主相互作用的研究中盡量選用規(guī)格接近的鮑作為受試對象。

圖1 不同劑量弧菌懸浮液注射后幼鮑死亡率隨培育時間的變化曲線Fig. 1 Cumulative mortality of juvenile abalones after vibrio challenging

2.3 供試弧菌對皺紋盤鮑侵染途徑的初步分析

2.3.1 創(chuàng)傷-浸浴侵染

經(jīng)創(chuàng)傷處理或不經(jīng)創(chuàng)傷處理的皺紋盤鮑分別在含1.0×108cfu/mL的bb3或bb4弧菌懸浮液中浸浴24 h后轉(zhuǎn)移到自然海水中培育2周。創(chuàng)傷對照組經(jīng)相同創(chuàng)傷處理但不進行弧菌浸浴, 2周后統(tǒng)計各處理組的死亡率, 結(jié)果見表2。溶藻弧菌bb3的創(chuàng)傷-浸浴處理組累積死亡率為 17.78%, 高于單純的浸浴處理組,顯著高于創(chuàng)傷對照組(P＜0.05); 哈氏弧菌 bb4的創(chuàng)傷-浸浴處理組死亡率為31.11%, 高于浸浴處理組鮑的死亡率為 22.22%, 顯著高于創(chuàng)傷對照組(P＜0.05)。上述結(jié)果表明, 弧菌懸浮液浸浴可致使受試鮑感染,創(chuàng)傷處理可使受試鮑被病原弧菌侵染的幾率增加,因此, 在養(yǎng)殖生產(chǎn)中任何減少、滅除特定病原弧菌的管理措施均有望減輕病情, 并且日常管理中應(yīng)盡量避免鮑遭受機械損傷。

圖2 菌株bb3和bb4對不同規(guī)格受試鮑的致死毒性Fig. 2 Pathogenicity of vibrio bb3 and bb4 for abalone of different sizes

表2 弧菌創(chuàng)傷-浸浴處理對受試鮑死亡率的影響Tab. 2 Effects of soaking -wound treatment on cumulative mortality of abalones

2.3.2 攝食感染

在本研究的一組實驗中, 我們觀察到 4個供試健康鮑啃食因注射哈氏弧菌 bb4懸浮液而死亡的皺紋盤鮑的軟體部組織, 這4個取食者在此后的4～7 d內(nèi)相繼死亡, 本研究的初步觀察結(jié)果表明, 同類相食可能是鮑病原傳播的途徑之一。圖 3是本研究的部分觀察結(jié)果, 箭頭所指處為皺紋盤鮑的尸體被啃食后留下的痕跡。

2.4 溶藻弧菌bb3和哈氏弧菌bb4胞外產(chǎn)物粗提液致死毒性的初步研究

利用平板玻璃紙覆蓋法制備弧菌胞外產(chǎn)物粗提液, 對受試皺紋盤鮑進行足部肌肉注射處理, 每個受試鮑分別注射溶藻弧菌 bb3或哈氏弧菌 bb4的胞外產(chǎn)物粗提液100 μL, 對照組注射等量的PBS溶液,實驗結(jié)果見圖4, 注射處理后次日即發(fā)現(xiàn)有供試鮑死亡, 處理后第6天, bb3胞外產(chǎn)物粗提液注射組累積死亡率達到60%、bb4處理組死亡率高達90%, 實驗期間對照組無死亡現(xiàn)象發(fā)生。本研究的結(jié)果表明, 不僅供試弧菌菌株侵染可導(dǎo)致皺紋盤鮑死亡, 它們的胞外產(chǎn)物對受試鮑也同樣具有致死效應(yīng)。但本研究僅進行了初步的定性實驗, 弧菌胞外產(chǎn)物致死效應(yīng)的劑量效應(yīng)關(guān)系及致死效應(yīng)機制等均值得深入研究。

圖3 被同類啃食過的幼鮑尸體Fig. 3 Dead abalone bodies bited by other abalones

2.5 供試弧菌的藥敏試驗

應(yīng)用紙片法測定供試弧菌對 20 種抗生素的敏感性, 結(jié)果見表3。結(jié)果表明, 溶藻弧菌bb3和哈氏弧菌 bb4對頭孢曲松和丁胺卡那霉素均表現(xiàn)出高度敏感性; 此外, 溶藻弧菌bb3對慶大霉素、復(fù)達欣、卡那霉素、紅霉素高度敏感; 而哈氏弧菌bb4則對四環(huán)素和強力霉素高度敏感; 但bb3和bb4卻分別對8種和11種抗生素表現(xiàn)出抗性, 其中青霉素、氨芐西林、苯唑西林、哌拉西林、羧芐青霉素和先鋒霉素Ⅳ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋辛等8種是2株供試弧菌均具抗藥性的抗生素。

表3 菌株bb3和bb4的藥敏試驗結(jié)果Tab. 3 Antibiotic susceptibility tests of bb3 and bb4

3 討論

我國皺紋盤鮑和雜色鮑養(yǎng)殖區(qū)均曾發(fā)生大面積的流行性病害, 細菌[5-7]和病毒[8-10]是歷次流行性死亡的主要病原生物[11], 而海洋弧菌是細菌性病原中最主要的一個類群。

皺紋盤鮑的自然分布區(qū)和傳統(tǒng)養(yǎng)殖區(qū)在我國北方的黃海海域, 我國皺紋盤鮑養(yǎng)殖區(qū)自 1992年開始曾發(fā)生非常嚴重的流行性病害, 研究人員先后從病患樣本中分離得到河流弧菌II(V. fluvialisⅡ)[5,12]、坎氏弧菌(V. campbellii)[6]和創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus)[7],侵染實驗表明它們均為皺紋盤鮑的致病菌。此后,從我國南方養(yǎng)殖的雜色鮑中陸續(xù)分離得到亮弧菌(V.splendidus)[13]、塔氏弧菌(V. tubiashii)[14]、溶藻弧菌[15-17]、副溶血弧菌(V. paralaemolyticus)[15-16]、霍亂弧菌(V.cholera)[16]、溶珊瑚弧菌(V. coralliiluyitcus)[17]及哈氏弧菌[18-19]等致病性弧菌。本研究從我國粵東養(yǎng)殖區(qū)分離得到的這2株弧菌分別為溶藻弧菌(bb3)和哈氏弧菌(bb4), 幼鮑被bb3或bb4感染后, 附著力普遍降低, 死亡個體外套膜收縮、腹足肌肉僵硬并有部分個體的腹足部出現(xiàn)白色膿皰[2]。侵染實驗表明菌株bb3和bb4及其胞外產(chǎn)物在20℃水溫下對1齡皺紋盤鮑表現(xiàn)出較強的致死毒性, 它們對皺紋盤鮑的致死毒性與弧菌濃度呈正相關(guān)、與皺紋盤鮑個體規(guī)格負相關(guān), 我們的初步結(jié)果表明 bb3和 bb4是皺紋盤鮑的致病菌, 它們可能是引起2011年秋冬季粵東地區(qū)養(yǎng)殖皺紋盤鮑大規(guī)模死亡的重要病原菌。

溶藻弧菌和哈氏弧菌此前已從閩粵養(yǎng)殖的雜色鮑中分離得到并被證明是雜色鮑的致病菌[15-19], 同時溶藻弧菌和哈氏弧菌也是中國北方養(yǎng)殖的水產(chǎn)動植物的常見病原菌, 但以往未見從中國北方分布或養(yǎng)殖的鮑科動物中分離出溶藻弧菌和哈氏弧菌的報道。本研究所用病原菌分離自廣東汕頭市南弘海珍養(yǎng)殖有限公司的皺紋盤鮑病患樣本, 該公司所處的汕頭市海門灣弧菌含量較高, 且以往從該公司養(yǎng)殖的雜色鮑中曾分離到哈氏弧菌, 本研究分離的弧菌菌株與以往從該海區(qū)養(yǎng)殖的雜色鮑中分離的弧菌菌株有哪些異同, 值得進一步研究。

鮑以海藻為食, 但在長期的研究中我們多次觀察到皺紋盤鮑啃食同類尸體的現(xiàn)象。本研究對皺紋盤鮑的同類相食行為在病害傳播中的作用進行了初步研究, 首次觀察到致病海洋弧菌可以通過宿主被健康鮑取食而傳播給健康個體, 這可能是鮑病原生物橫向傳播的重要方式之一。因此, 我們建議在鮑人工養(yǎng)殖過程中及時清除病死個體。及時清除病死個體不僅可避免尸體腐爛導(dǎo)致養(yǎng)殖水體的水質(zhì)敗壞,而且可切斷病原生物在養(yǎng)殖生物之間的傳播。

本文對菌株bb3和bb4及其胞外產(chǎn)物的侵染毒性、侵染途徑及對抗生素的敏感性進行了初步研究,結(jié)果已反映出我國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)存在的一些現(xiàn)象可能導(dǎo)致的危害, 比如: 對水產(chǎn)生物異地移養(yǎng)缺乏制約客觀上增加了病害傳播的速度和范圍、并增大了病原生物在物種之間橫向傳播的風(fēng)險; 使用抗生素不規(guī)范導(dǎo)致病原微生物出現(xiàn)耐藥性——在本研究中我們測試了供試弧菌對20種抗生素的敏感性, 發(fā)現(xiàn)僅有2種抗生素是這2株弧菌均高度敏感的, 但這2株海洋弧菌同時表現(xiàn)出抗性的抗生素卻達到 8種之多。菌株 bb3和 bb4均具備抗藥性的這 8種抗生素分別屬于青霉素類和頭孢菌素類, 是人類醫(yī)學(xué)及畜牧、水產(chǎn)業(yè)中最廣泛使用的2大類抗生素。

致謝: 感謝孫黎博士對本文提出有益建議。

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