磁性殼聚糖微球的合成及其在固定化血管緊張素轉化酶的應用

周敬豪，徐存華，李玉嬋，黃順禮，熊珍愛，孫建華，蔣林斌，童張法，廖丹葵

（廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004）

磁性微球是近 20年來發(fā)展起來的一種新型功能高分子材料，由于它同時具有無機磁性載體、超順磁響應性以及表面功能化修飾等優(yōu)點[1]，在外磁場作用下可快速從反應介質中分離出來，因而在生物技術、化學、環(huán)境治理等領域得到了廣泛的應用[2]。殼聚糖是具有很好生物相容性的天然多糖材料，其分子鏈上含大量的羥基和氨基可進行修飾和功能化，因此廣泛用于酶的固定化[3-4]。

血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的一種酶類，其在體內不僅可以將血管緊張素Ⅰ轉化為血管緊張素Ⅱ，還會分解緩激肽，這都會導致人體內血壓的升高。許多科研工作者通過篩選ACE抑制劑來尋找抗高血壓類物質，但篩選ACE抑制劑需要大量的ACE[5]。商業(yè)ACE價格十分昂貴，從動物組織中提取ACE卻又存在過程繁瑣，產量極低，易失活等缺點。若將ACE固定在載體上，可以大大提高酶穩(wěn)定性和循環(huán)利用率。

洪韞嘉、劉宏等[5-6]以硫酸銨分級沉淀、透析平衡、親和分離等多步純化的高純度豬肺 ACE為原料，研究了殼聚糖和Sepharose CL-4B固定化ACE的性質，但以豬肺二級沉淀粗提ACE為原料的固定化ACE尚無文獻報道，因此，本實驗擬以豬肺二級沉淀粗提ACE為原料，研究磁性殼聚糖固定化ACE的效果和固定化酶性質，為簡化固定化酶的前處理提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖，脫乙酰度≥95%，浙江金殼生物化學有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL），美國Sigma公司；環(huán)氧氯丙烷、三氟乙酸，分析純，中國國藥集團；FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O、50%戊二醛、乙酸、氨水、Span-80、油酸等均為國產化學純。

SK8200HP數(shù)控超聲波清洗器（上海）；NICOLET 6700傅里葉變換紅外光譜儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；Nano-S激光納米粒度分析儀（Malvern，英國）；STA 449 F3 Jupiter同步熱分析儀（NETZSCH，德國）；1260 液相色譜儀（Agilent，德國）；7400振動樣品磁強計（Lake Shore，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 改性 Fe3O4磁性納米粒子及磁性殼聚糖微球的制備

采用化學共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒子[7]。配制一定濃度的 FeCl3·6H2O 和 FeCl2·4H2O 溶液，置于250 mL三口燒瓶中，通入氮氣，高速攪拌條件下滴加濃氨水，至溶液變成黑亮色，加入油酸改性，攪拌熟化30 min。反應結束后，磁鐵分離收集，去離子水清洗干凈，真空干燥。

將殼聚糖溶于 2%的乙酸溶液中，加入 Fe3O4磁性納米粒子混合，超聲分散，高速攪拌條件下，緩慢將殼聚糖混合溶液滴加到裝有液體石蠟和Span-80的三口燒瓶中，攪拌30 min，加入交聯(lián)劑戊二醛，繼續(xù)攪拌1 h，調節(jié)pH值到9，攪拌1 h后結束反應。產物依次用石油醚、乙醇、去離子水洗滌干凈，磁鐵分離收集，真空干燥并進行表征[8]。

殼聚糖與戊二醛的交聯(lián)反應及磁性殼聚糖微球的合成過程分別如圖1和圖2所示。

1.2.2 Fe3O4納米粒子及磁性殼聚糖微球的性能表征

樣品粒徑分布采用激光納米粒度分析儀進行測定；結構采用傅里葉變換紅外光譜儀進行分析；磁學性能采用振動樣品磁強計進行分析；熱失重過程采用同步熱分析儀進行分析[9]。

1.2.3 血管緊張素轉化酶（ACE）的固定化

從新鮮豬肺中提取二級沉淀 ACE粗酶[10]。稱取一定量磁性殼聚糖微球，加入環(huán)氧氯丙烷，在40℃條件恒溫水浴搖床中活化4 h。再稱取一定量活化后的磁性殼聚糖微球，按質量體積比1∶10加入二級沉淀的ACE粗酶溶液（由含0.3 mol/L NaCl的0.1 mol/L硼酸鹽緩沖溶液配制，pH值8.3），在50 ℃恒溫水浴搖床中反應1.5 h。反應結束后，用去離子水和緩沖溶液洗滌固定化ACE的磁性殼聚糖微球，磁鐵分離收集。加入硼酸鹽緩沖溶液，4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2.4 ACE活性測定方法

溶液酶活性測定[11]：以HHL作為酶反應底物，酶反應催化生成的馬尿酸（HA）作為檢測指標。取20 μL ACE 酶液，加入 40 μL 底物溶液和 140 μL 緩沖液，在37 ℃下反應30 min，加入25 μL 2 mol/L鹽酸終止反應。反應液用0.45 μm纖維膜過濾后進液相檢測生成的HA的含量。1個酶活力單位（U）定義：在本實驗條件下，每分鐘催化底物 HHL生成1 μmol產物HA所需的酶量。

固定化酶活性測定：與測定溶液酶的方法相同，每次取30 mg固定化酶微球，加入40 μL底物溶液和160 μL緩沖液，在37 ℃下反應30 min，4 ℃冷凍離心，取上清液加入25 μL鹽酸終止反應，用0.45 μm纖維膜過濾后進樣。固定化ACE活力單位（U）定義：在本實驗條件下，1 g固定化酶1 min催化底物HHL生成1 μmol產物HA為1個活力單位。

2 結果與討論

2.1 磁性殼聚糖微球結構性能表征

2.1.1 粒度分析

粒徑分布是評價 Fe3O4磁性納米粒子和磁性殼聚糖微球的分散性和均一性的重要指標。Fe3O4磁性納米粒子和磁性殼聚糖微球的粒徑分布如圖3和圖4所示。由圖3、圖4可知，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子平均粒徑大約為6 nm，磁性殼聚糖微球的粒徑分布比較窄，平均粒徑大約為901 nm，具有良好的體表效應，單位微球表面的活性基團越多，可交聯(lián)結合的游離酶越多，因此可將磁性殼聚糖微球應用于酶的固定化。

2.1.2 傅里葉紅外光譜（FT-IR）分析

圖5中a、b、c分別為Fe3O4納米粒子、殼聚糖及磁性殼聚糖微球的紅外光譜圖。其中，584 cm?1處為Fe3O4中Fe—O的特征吸收峰；3500 cm?1處強的吸收峰為—NH2中N—H鍵不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動峰；3388 cm?1、3290 cm?1是O—H和N—H的伸縮振動峰； 2921 cm?1、2867 cm?1處為羧羥基和脂肪族碳氫的伸縮振動峰；1559 cm?1處為酰胺特征吸收峰；1400 cm?1左右為—CH2的彎曲振動、—CH3的變形振動峰；1062 cm?1處為C—O伸縮振動峰。譜線c為磁性殼聚糖微球的紅外譜圖，譜圖中不僅保留了殼聚糖原有的特征吸收峰，且在590 cm?1處出現(xiàn)了Fe3O4的Fe—O特征吸收峰，說明了制備的磁性殼聚糖微球包裹了Fe3O4磁性納米粒子。

2.1.3 磁響應性分析

Fe3O4納米粒子和磁性殼聚糖微球的磁性分析結果如圖6。由圖6可知，F(xiàn)e3O4納米粒子和磁性殼聚糖微球均具有超順磁性，F(xiàn)e3O4納米粒子和磁性殼聚糖微球的飽和磁化強度分別為37.24 emu/g和7.93 emu/g，磁核包裹殼聚糖后，由于復合微球體積變大，磁性受到影響，但仍具有良好的磁響應性，可用于后續(xù)的固定化酶的快速收集。

2.1.4 熱重分析

圖7為磁性殼聚糖微球熱重分析結果，從室溫升至120 ℃，其14%的失重應為樣品中吸附水的脫除[12]。從120 ℃升溫到700 ℃，其 58%的失重為磁性微球中殼聚糖的熱分解及 Fe3O4骨架上 H、N的脫去。700 ℃后樣品質量基本不變，由于 Fe3O4在N2氣保護下不會分解，因此可知磁性殼聚糖微球中Fe3O4的含量約為28%。

2.2 磁性殼聚糖微球固定化ACE條件優(yōu)化

2.2.1 固定化最適pH值的確定

從新鮮豬肺中提取二級沉淀物為ACE粗酶，按1.2.4節(jié)條件分析得ACE粗酶活性為0.048 U/mg。

取5組經活化處理的磁性殼聚糖微球，分別加入5 mL pH值范圍從7.3～9.3 硼酸鹽緩沖液配制的ACE酶溶液，按1.2.3節(jié)條件對ACE進行酶固定化，不同pH值條件下固定化酶活性結果見圖8。由圖8可知，固定化酶活性隨pH值升高先上升而后下降。當pH值為8.3時，固定化酶活性最高，因此選取pH值 8.3進行酶固定化。

2.2.2 固定化最適反應溫度的確定

不同固定化溫度下固定化酶活性結果見圖 9。由圖9可知，固定化酶活性隨反應溫度升高呈先上升而后下降。當溫度為 50 ℃時，固定化酶活性最高，超過 50 ℃后，酶活性迅速下降，原因可能是酶活性部位因溫度升高而遭到破壞，導致固定化酶失活，活性下降，因此選取50 ℃為最適固定化溫度。

2.2.3 固定化最適反應時間的確定

不同固定化時間下固定化酶活性結果見圖10。由圖10可知，隨反應時間不斷增加，固定化酶活性增大。當反應超過1.5 h后，固定化酶活性開始下降，原因可能是此時微球負載酶量已達到飽和，延長反應時間只會增大酶空間位阻而致使酶活性變小，因此選取1.5 h為最適固定化時間。

2.2.4 固定化最適蛋白濃度的確定

不同濃度 ACE酶液固定化酶的活性變化見圖11。由圖11可知，隨著粗酶液濃度增大，固定化酶活性也不斷增大。當粗酶液濃度為6 mg/mL時，固定化酶活性達到最大。繼續(xù)增大粗酶液濃度，固定化酶活性反而呈微弱下降趨勢。這是因為磁性殼聚糖微球表面的活性基團和酶的結合已趨于飽和，再增加酶液濃度，酶不但不和活性基團結合，反而會使酶都聚集在一起，對酶活性中心造成阻礙，導致酶活性下降。因此，固定化的最適酶液濃度為 6 mg/mL，此時固定化酶活最大為0.048 U/g微球。

2.3 固定化酶性質考察

2.3.1 pH值對酶活性的影響

相同酶活力的游離ACE和固定化ACE在不同pH值條件下酶活變化如圖12所示。由圖12可知，雖然固定化酶和游離酶在pH值7.8處都具有最高的活力，但固定化酶的適合pH值范圍要寬于游離酶，可能是固定化后ACE的構象發(fā)生了改變，因此在較寬的pH值范圍內較為穩(wěn)定。

2.3.2 溫度對酶活性的影響

相同活力游離ACE和固定化ACE在不同溫度下酶活變化如圖13。由圖13可知，游離酶在42 ℃時具有最高酶活力，繼續(xù)升高溫度，酶活力快速下降；而固定化酶在 47 ℃時具有最大酶活力，說明酶固定化后提高了熱穩(wěn)定性，其適用范圍較游離酶更寬。

2.3.3 固定化酶的操作穩(wěn)定性

重復使用性是固定化酶在應用方面的一個重要指標。使用磁性殼聚糖固定化酶連續(xù)測定酶活力10次，結果見圖14。從圖14可知，固定化酶使用10次后，其相對活力仍然保持在40%以上，顯示出較高的操作穩(wěn)定性。

2.3.4 固定化酶的儲藏穩(wěn)定性

將固定化酶置于pH值8.3硼酸緩沖液，4 ℃冰箱中保存30天后，其活力為初始酶活力的82%，這表明固定化酶具有良好的儲藏穩(wěn)定性。

本實驗采用豬肺二次鹽析沉淀的粗酶為原料進行固定化，操作簡便，省略了透析、凝膠層析、離子交換等多步分離純化過程，除固定化酶活比文獻[5]報道的0.085 U/g偏低外，固定化酶的其它性質均與文獻報道相近，同時，由于采用磁性微球為固定化載體，該固定化酶在使用過程中進行分離較其它的固定化載體更為方便和快速。

3 結 論

（1）采用乳化交聯(lián)法制備了磁性殼聚糖微球，并對磁核和磁性殼聚糖微球結構進行了表征。結果表明，磁性微球平均粒徑為901 nm，具有良好的磁響應性和超順磁性。

（2）以磁性殼聚糖微球作為固定化載體，對粗提血管緊張素轉化酶進行固定化，并對固定化條件進行了優(yōu)化，得到固定化ACE的最佳條件為：pH值 8.3，溫度為50 ℃，反應1.5 h，酶液蛋白濃度為 6 mg/mL，此時固定化酶活力最高為 0.048 U/g微球。

（3）對磁性殼聚糖微球固定化酶進行性質研究，實驗結果表明，與游離酶相比，固定化酶 pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性均得到提高。固定化酶具有較好的重復使用性和儲藏穩(wěn)定性。

[1]宋艷艷，孔維寶，宋昊，等.磁性殼聚糖微球的研究進展[J].化工進展，2012，31（2）：345-354.

[2]周瑾，周作明，荊國華.磁性固定化技術在環(huán)境工程領域的研究和應用進展[J].化工進展，2011，30（5）：1106-1111.

[3]Wang Y J，Wang X H，Luo G S，et al.Adsorption of bovin serum albumin(BSA) onto the magnetic chitosan nanoparticles prepared by a microemulsion system[J].Bioresource Technology，2008，99：3881-3884.

[4]Li G Y，Zhou Z D，Li Y J，et al.Surface functionalization of chitosan-coated magnetic nanoparticles for covalent immobilization of yeast alcohol dehydrogenase fromSaccharomyces cerevisiae[J].Journal of Magnetism and Magnetic Materials，2012，322：3862-3868.

[5]洪韞嘉，李譚瑤，陳波，等.殼聚糖固定化血管緊張素轉化酶及其性質[J].高等學?；瘜W學報，2009， 30（2）：328-331.

[6]劉宏，陳蘭英.血管緊張素轉換酶的固相化與性質[J].中國醫(yī)學科學院學報，2000，22（6）：558-561.

[7]王紅英，常凱.磁性殼聚糖微球的制備及其性能[J].大連工業(yè)大學學報，2011，30（2）：105-108.

[8]Fan L L，Luo C N.Preparation of magnetic modified chitosan and adsorption of Zn2+from aqueous solutions[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2011，88：574-581.

[9]Yan H，Yang L Y，Yang Z，et al.Preparation of chitosan/poly(acrylic acid) magnetic composite microspheres and applications in the removal of copper(Ⅱ) ions from aqueous solutions[J].Journal of Hazardous Materials，2012，229-230：371-380.

[10]劉宏，陳蘭英.親和層析法分離純化豬肺血管緊張素轉換酶[J].生物化學與生物物理進展，2000，27（5）：544-547.

[11]廖丹葵，孫秀華，萬順剛，等.酶法水解和篩選蛋黃蛋白質中的藥物前驅型降血壓肽[J].精細化工，2006，23（8）：757-759.

[12]Zhang L Y，Zhu X J，Sun H W，et al.Control synthesis of magnetic Fe3O4-chitosan nanoparticles under UV irradiation in aqueous system[J].Current Applied Physics，2012，10（3）：828-833.