微波輔助提取白花丹中黃酮的最佳工藝研究

朱偉偉

(河池學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西 宜州 546300)

0 引言

白花丹為白花丹科植物白花丹(Plumbago zeylanica L.)的全草或根，始載于《唐本草》，入藥首載于《生草藥性備要》，別名:烏面馬、白雪花、白皂藥、山波苓、一見消、白花藤、火靈丹、假茉莉、猛老虎、白花巖陀等。生于氣候溫暖潮濕的地區(qū)，常見于向陽的小溝邊，分布于云南、貴州、廣西、廣東、福建和臺灣等省區(qū)，為東南亞許多國家及我國多民族醫(yī)用藥材［1－2］。白花丹在臨床上主要用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛、皮膚瘙癢、皮膚無名腫毒、跌打損傷、婦女產(chǎn)后流血不止及一些惡性疾病(如惡性腫瘤)［3］的治療等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:白花丹具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗肝損傷以及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用［4－5］，特別是抗腫瘤作用已引起高度重視，顯示出很好的開發(fā)、利用價(jià)值。

目前從白花丹植物中分離得到的化學(xué)成分主要包括萘醌類、香豆素類、黃酮類、有機(jī)酸類、甾族類等成分［6］。張倩睿等［7］首次從白花丹中分離得到對羥基苯甲醛、香蘭子酸、2，5—二甲基—7—羥基—色原酮、3—吲哚甲醛。但關(guān)于白花丹中總黃酮的提取研究報(bào)道較少。前期研究表明用微波法提取中草藥中的總黃酮效果比較好［8］。本文以乙醇為提取劑，以白花丹總黃酮的提取量為指標(biāo)，采用微波輔助法通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，旨在確定微波法萃取白花丹總黃酮的最佳工藝，為進(jìn)一步研究白花丹的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

白花丹(購于宜州市藥材市場);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物有限公司，純度＞98%);無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁(均為分析純)。

Q－250A3高速多功能粉碎機(jī)(上海冰都電器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)療設(shè)備廠);722N型可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SHB－3型循環(huán)水多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);電熱恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)療設(shè)備廠);美的微波爐(AG832MF4－NR1)。

2 方法及結(jié)果

2.1 黃酮含量測定

2.1.1 樣品的制備及處理

將白花丹放入電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥，然后用粉碎機(jī)粉碎，過20目篩，放入干燥的燒杯中備用。準(zhǔn)確稱取1.00 g的白花丹粉末置于250 mL錐形瓶中，以乙醇為提取試劑，按不同比例加入不同濃度的乙醇溶液搖勻，將瓶口用保鮮膜封住，在不同微波功率下輻射加熱一定時(shí)間，微波作用后于80℃下恒溫水浴30 min，使黃酮盡量溶出，將浸提液進(jìn)行減壓抽濾，將濾液定容至50 mL，得到白花丹黃酮的提取液，備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取蘆丁對照品5 mg，用50%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，制成0.1 g/L的蘆丁對照品溶液。分別吸取上述溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于25 mL的比色管中，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇稀釋至10 mL，加入5%NaOH溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min;再加10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，然后加1 mol/L NaOH溶液2 mL，再用50%乙醇定容25 mL，搖勻，靜置15 min，不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，只加顯色劑同法制得空白對照液，在510 nm處測定其吸光度。得回歸直線方程為:Y=0.011 4x－0.000 4(r=0.999 7)，結(jié)果表明蘆丁在4～20 mg/L時(shí)，濃度與吸光度線性良好。

2.1.3 總黃酮的含量測定

精確吸取白花丹提取液1 mL于25 mL的比色管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行顯色，在510 nm波長處測定吸收度，代入回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮的質(zhì)量濃度。

2.1.4 回收率試驗(yàn)

精密量取已知總黃酮含量的提取液6份，分別加入0.1 g/L蘆丁對照品溶液0.5 mL，按2.1.2方法，測定吸光度，算出黃酮的平均提取率97.62%。結(jié)果見表1。

表1 白花丹總黃酮提取液蘆丁加樣回收率試驗(yàn)

2.1.5 精密度試驗(yàn)

精確吸取提取液1 mL置于25 mL比色管中，按2.1.2方法測定平均吸光度0.263 5，RSD 0.47%。

2.2 單因素考察

2.2.1 乙醇濃度對白花丹總黃酮提取率的影響

精確稱取1.00 g白花丹粉末置于250 mL錐形瓶中，按固液比為1∶25依次加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，選取微波功率為300 W的條件下，微波輻射90 s，之后在80℃下恒溫水浴30 min，按2.1.2方法測吸光度，計(jì)算總黃酮提取率分別為3.14%，3.38%，3.31%，3.25%，3.09%，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)總黃酮提取率最大(見圖1)，故選擇乙醇的體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.2.2 料液比對白花丹總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取白花丹粉末 1.00 g，按料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 依次加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，選取微波功率為300 W，微波輻射時(shí)間為90 s，然后在80℃下恒溫水浴30 min，按2.1.2方法測吸光度，計(jì)算總黃酮提取率分別為3.36%，3.54%，3.65%，3.53%，3.41%，固液比為1∶25時(shí)總黃酮提取率最大(見圖2)，故選擇1∶25。

圖1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

圖2 料液比對總黃酮提取率的影響

2.2.3 微波輻射時(shí)間對白花丹總黃酮提取率的影響

精確稱取白花丹粉末1.00 g，按固液比為1∶25分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇溶液，選取微波功率為300 W，分別作用30 s、60 s、90 s、120 s、150 s，在80 ℃下恒溫水浴30 min 后，按2.1.2 方法測吸光度，計(jì)算總黃酮提取率分別為3.62%，3.68%，3.79%，3.62%，3.27%，微波輻射時(shí)間為90 s時(shí)總黃酮提取率最大(見圖3)，故選擇90 s作為微波輻射時(shí)間。

2.2.4 微波輻射功率對白花丹總黃酮提取率的影響

精確稱取白花丹粉末1.00 g，按固液比為1∶25依次加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，分別以微波輻射功率為100 W、200 W、300 W、400 W、500 W微波作用時(shí)間90 s的條件下，然后在80℃下恒溫水浴30 min，按2.1.2方法測吸光度，計(jì)算總黃酮提取率分別為3.31%，3.68%，3.73%，3.45%，3.37%，微波輻射功率為300 W時(shí)總黃酮提取率最大(見圖4)，故微波功率選取300 W。

圖3 微波輻射時(shí)間對黃酮提取率的影響

圖4 微波輻射功率對黃酮提取率的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對各單因素的微波作用時(shí)間(A)、料液比(B)、乙醇濃度(C)、微波輻射功率(D)對黃酮提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)，并以總黃酮的提取率為判斷指標(biāo)，根據(jù)設(shè)置選用L9(34)正交表，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2、表3。

表2 白花丹總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)因素水平

表3 白花丹總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)安排

由表2、表3極差分析結(jié)果可以看出，影響白花丹總黃酮提取率的因素主次順序?yàn)镃＞A＞D＞B，即乙醇濃度＞微波輻射時(shí)間＞微波輻射功率＞料液比。確定最佳提取工藝組合為:A1B2C3D3，即微波輻射時(shí)間60 s、料液比1∶25、乙醇濃度60%、微波功率400 W。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

精確稱取1.00 g白花丹粉末，在優(yōu)化組合條件A1B2C3D3下，冷卻，過濾，按2.1.2方法，測定吸光度，進(jìn)行5次平行驗(yàn)證性試驗(yàn)，最佳工藝條件的驗(yàn)證結(jié)果是總黃酮平均得率為4.19%，RSD為0.8982%，說明該工藝穩(wěn)定。

3 結(jié)論

用微波輔助法提取白花丹中總黃酮，微波照射時(shí)間不宜過長，以60～120 s為宜，超過此時(shí)間，會使提取率降低，這可能因?yàn)檎丈鋾r(shí)間過長會導(dǎo)致溫度過高而使得黃酮類物質(zhì)分解;微波的功率在400 W左右比較適宜，過高也會造成黃酮類物質(zhì)受熱過高而分解，使萃取量下降;料液比在1∶25最為合適，當(dāng)比值增大時(shí)萃取的黃酮量反而減少，可能是因過多的提取液吸收了大量的微波能，造成了藥品吸收能量減少;乙醇體積分?jǐn)?shù)是四個(gè)因素中影響最大的，其取值在50% ～60%最為合適，這可能和總黃酮中的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

［1］韋金育，李延，韋濤.50種廣西常用中草藥、壯藥抗腫瘤作用的篩選研究［J］.廣西中醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，6(4):3.

［2］宋立人，洪恂，丁緒亮，等.現(xiàn)代中藥學(xué)大詞典(上冊)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:283.

［3］劉圓，劉超，顏曉燕，等.白花丹不同提取部位體外抗腫瘤及急毒研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(4):557.

［4］顏曉燕，盛艷梅，辛志偉.民族藥材白花丹體外抗腫瘤活性研究［J］.成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，l(2):106.

［5］張吉仲，劉圓，焦?jié)?白花丹不同有機(jī)溶劑提取物和白花丹醌對移植性乳腺癌和S 180肉瘤的作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(18):1 040.

［6］楊蕾，郭利民，鐘世華，等.微波輔助萃取艾葉中總黃酮的工藝研究［J］.湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào).2008，5(3):37.

［7］張倩睿，梅之南，楊光忠，等.白花丹化學(xué)成份的研究［J］.中藥材，2007，30(5):558.

［8］耿紅梅，張彥，曹麗慧，等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選白花菜子總黃酮的最佳提取工藝［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，23(4):886.