畢赤酵母表達系統(tǒng)研究進展

馬銀鵬，王玉文，黨阿麗，孔祥輝，2，張介馳，2

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010;2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150020)

大腸桿菌(Escherichia coli)表達系統(tǒng)由于其具有遺傳背景和生化特性清楚、成本低廉、操作簡便、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點最早被采用作為外源基因表達系統(tǒng)。但大腸桿菌表達系統(tǒng)缺少真核生物的蛋白翻譯后進行加工和修飾的功能，表達的蛋白大部分以包含體形式存在，且需要經(jīng)過復(fù)雜的復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象和活性以及背景雜蛋白較多[1］，為克服這些缺點，人們于1979年開發(fā)了酵母表達系統(tǒng)。

酵母是單細胞低等真核生物，既具有原核生物細胞生長速度快、容易培養(yǎng)、操作簡單等優(yōu)點，又具有真核生物表達時對蛋白質(zhì)的加工和修飾等功能。因此相對于原核表達系統(tǒng)表達出的不具有活性的蛋白，酵母表達出的蛋白是具有生物學(xué)活性的，而且酵母表達系統(tǒng)比其他真核表達系統(tǒng)如昆蟲、哺乳動物組織等表達系統(tǒng)快速、簡便、成本低[2］。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)最早被用作酵母表達系統(tǒng)的宿主。1981年Hitzeman等用它成功表達了人干擾素基因[3］。第一個商品化的重組疫苗也是由釀酒酵母表達的[4］。釀酒酵母全基因組于1996年測序完成，更多的蛋白如乙肝表面抗原、人胰島素、人血清蛋白和降鈣素等通過其成功表達[5］。由于其具有難以高密度培養(yǎng)，缺乏強有力的啟動子，分泌效率低等局限性[1，6］，因此人們在此基礎(chǔ)上又尋找了新的酵母表達系統(tǒng)宿主——畢赤酵母(Pichia pastoris)[7］。

1 畢赤酵母表達系統(tǒng)的特點

畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型酵母，以甲醇為唯一的碳源和能源[8］。畢赤酵母具有強有力的醇氧化酶基因AOX啟動子，是目前最強、調(diào)控機制最嚴(yán)格的啟動子之一。它能夠嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達，使外源基因只在含有甲醇的培養(yǎng)基中有效表達?；蚪M中存在兩個基因AOX1和AOX2，對AOX基因進行編碼，兩個基因的同源性為92%，編碼蛋白質(zhì)的同源性高達97%。AOX1啟動子受到甲醇的誘導(dǎo)強烈，但是AOX2啟動子受甲醇誘導(dǎo)較弱[9］。一般情況下外源基因整合到畢赤酵母染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，不易丟失，遺傳性狀穩(wěn)定。畢赤酵母在氧氣充足時能快速生長，通過連續(xù)培養(yǎng)可形成很高的細胞密度。因此，畢赤酵母可應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)[10］。在1993年，RCT(Research Corporation Technologies)允許畢赤酵母表達系統(tǒng)用于學(xué)術(shù)研究，這使該系統(tǒng)的知識庫呈現(xiàn)了爆炸性增長[2］。

2 畢赤酵母表達系統(tǒng)的組成

2.1 表達宿主

目前利用的畢赤酵母表達宿主是由野生菌株NRRLY 11430(Northern Regional Research Laboratories， IL，USA)改良的。常用的畢赤酵母菌株有組氨酸缺陷型、腺嘌呤缺陷型和蛋白酶缺陷型。所有菌株均屬于組氨酸缺陷型，這類菌株只能在含有組氨酸的培養(yǎng)基中生長，這有助于在無組氨酸的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化成功含有組氨酸質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子[7］。PMAD11和 PMAD16屬于腺嘌呤缺陷型。SMD1163、SMD1165和SMD1168為蛋白酶缺陷型，基因組中缺失編碼蛋白酶A(pep4)或編碼蛋白酶B(prb1)的基因，減弱了蛋白酶對外源蛋白的降解作用，為外源基因的高效表達提供了一個穩(wěn)定的環(huán)境，適用于分泌型表達。由于畢赤酵母中1個或2個AOX基因的缺失，造成其對甲醇的利用能力不同，畢赤酵母菌株分為3種表現(xiàn)型。GS115、SMD1163、SMD1165和SMD1168菌株含有完整的AOX1和AOX2，在甲醇為唯一碳源時，強烈誘導(dǎo)啟動子使外源基因大量表達，為甲醇快速利用型Mut+。其中以GS115應(yīng)用最廣泛。KM71菌株無AOX1但是有AOX2，利用甲醇效率較低，為甲醇慢速利用型Muts。MC100－3菌株中的AOX1和AOX2均被敲除，不能利用甲醇，為甲醇不能利用型Mut－。常見畢赤酵母菌株、基因型和表現(xiàn)型如表1所示:

表1 畢赤酵母表達菌株Tab.1 The host strains of P.pastoris expression system

2.2 表達載體

畢赤酵母中沒有穩(wěn)定的天然質(zhì)粒，通常利用整合型穿梭質(zhì)粒作為外源基因的表達載體。攜帶外源基因的表達載體先在大腸桿菌中復(fù)制擴增，然后導(dǎo)入宿主細胞中與酵母細胞染色體基因組整合，表達外源蛋白。典型的畢赤酵母表達載體含5'AOX1啟動子、3'AOX1終止子、his4營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志、多克隆位點、大腸桿菌Ampr和ori序列[1］。

畢赤酵母表達載體中沒有酵母復(fù)制起點，它依靠AOX1或HIS4基因的位置同源重組整合進入酵母染色體中。質(zhì)粒整合到畢赤酵母染色體有單一交叉插入和雙交換兩種方式。含有外源基因的載體通過單交換方式插入宿主染色體的HIS4位點或AOX1的上游或下游，AOX1基因仍能正常表達，得到的多拷貝的轉(zhuǎn)化子，表型為Mut+。含有外源基因的載體通過雙交換方式插入到染色體AOX1基因位點，不能正常表達AOX1基因，但是可以表達AOX2基因，形成的單拷貝轉(zhuǎn)化子，表型為Muts。

載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中的方式包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法、聚乙二醇法和氯化鋰法。其中原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和氯化鋰法轉(zhuǎn)化效率較高[11］。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法易形成高拷貝數(shù)，但是步驟較煩瑣，且易污染。電轉(zhuǎn)化法操作簡便，不易污染，現(xiàn)已廣泛使用。其他兩種方法轉(zhuǎn)化效率較低[12］。

2.2.1 啟動子

畢赤酵母中最常用的表達外源蛋白的啟動子是醇氧化酶基因啟動子(PAOX1)。Yu[13］利用 PAOX1啟動子在畢赤酵母GS115中成功表達了超氧化物歧化酶，表達的蛋白具有免疫學(xué)活性和酶活性。Ghaffar等[14］也利用該啟動子在畢赤酵母GS115中成功表達了來自嗜熱毛殼菌的耐熱木聚糖酶，培養(yǎng)96 h后的最大胞外酶活性達15.6 U/mL。但是該啟動子也存在一定的缺陷，如甲醇有毒、易揮發(fā)，誘導(dǎo)時需連續(xù)添加甲醇，不適用于食品生產(chǎn)，大量甲醇積累可能會引發(fā)火災(zāi)。3－磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子(PGAP)經(jīng)葡萄糖誘導(dǎo)能提供與PAOX1啟動子相當(dāng)?shù)谋磉_水平，而且培養(yǎng)過程中不需要更換碳源。Vellanki等[15］利用PGAP啟動子成功地在畢赤酵母中表達了乙肝表面抗原。Yang等[16］也利用該啟動子在畢赤酵母中表達了－淀粉酶。但是PGAP啟動子不適用于表達對酵母有毒性作用的蛋白。谷胱甘肽依賴性甲醛脫氫酶基因(FLD1)編碼畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)途徑中的一種關(guān)鍵酶，該基因可被甲醇和甲胺誘導(dǎo)表達，也可被用作畢赤酵母啟動子(PFLD1)。當(dāng)利用甲胺誘導(dǎo)外源蛋白表達時，可以利用葡萄糖或甘露糖取代甲醇作為碳源，或者甲醇既是碳源又是誘導(dǎo)劑[17］。

2.2.2 選擇標(biāo)記

表達載體上的選擇標(biāo)記基因可用于篩選陽性轉(zhuǎn)化子和高拷貝轉(zhuǎn)化子。營養(yǎng)缺陷型基因如HIS4、SUC2、ARG4等已經(jīng)被用來連接到營養(yǎng)缺陷型的宿主菌株上，用于篩選陽性轉(zhuǎn)化子。抗生素抗性基因如Zeocin、Kanr等都能在畢赤酵母中表達，常用于篩選高拷貝的陽性轉(zhuǎn)化子。一般是先篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，然后再篩選出高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子。

2.2.3 信號肽

畢赤酵母表達的外源蛋白可通過細胞內(nèi)和細胞外兩種方式表達。細胞外表達外源蛋白優(yōu)于細胞內(nèi)表達，由于畢赤酵母分泌很少的自身蛋白，而細胞外表達可避免從細胞內(nèi)分離蛋白，且培養(yǎng)基中不需要添加蛋白質(zhì)，因此在培養(yǎng)基中分泌蛋白占大部分，有利于對外源蛋白的分離純化。將外源蛋白分泌到細胞外需要在表達載體上添加信號肽序列鏈接到分泌途徑。目前應(yīng)用較成功的信號肽有釀酒酵母交配因子信號肽、酸性磷酸酶信號肽、蔗糖酶信號肽等。釀酒酵母交配因子信號肽是目前應(yīng)用最廣泛也是最成功的信號肽，在一些情況下優(yōu)于外源蛋白的前導(dǎo)序列，但是利用該因子作為外源蛋白的信號肽有時會使N末端氨基酸序列發(fā)生變異。

3 外源基因表達的影響因素

畢赤酵母中外源基因的表達受到多種因素的影響，主要包括外源基因的性質(zhì)和畢赤酵母培養(yǎng)條件兩個方面。外源基因的性質(zhì)主要包括UTR序列、A+T含量、密碼子和基因拷貝數(shù)等。畢赤酵母培養(yǎng)條件主要包括培養(yǎng)基、溫度、pH值、通氣和甲醇誘導(dǎo)等。研究發(fā)現(xiàn)可以通過改變外源基因的性質(zhì)和優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因在畢赤酵母中高效表達。

3.1 外源基因的性質(zhì)

3.1.1 UTR 序列

mRAN 5'和3'非翻譯區(qū)(UTR)的長度和序列可能影響外源基因的表達。UTR太長或太短都會造成核糖體40S亞單位的識別障礙，影響外源基因的表達。適當(dāng)長度的5'UTR能夠極大促進mRNA的高效表達。

3.1.2 A+T 含量

在畢赤酵母表達系統(tǒng)中，局部A+T含量過高會使外源基因表達提前終止。可能是因為A+T含量豐富的區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄提前終止信號，使外源基因不能有效轉(zhuǎn)錄，因此外源基因中A+T含量影響外源基因的表達量。對A+T含量豐富的基因應(yīng)利用畢赤酵母外源基因表達序列的優(yōu)化軟件重新設(shè)計序列，使A+T含量控制在30% ～55%理論范圍內(nèi)。優(yōu)化軟件綜合考慮密碼子的使用頻率和A+T含量因素，優(yōu)化后的序列與AOX1存在相似的特性，因此可使外源基因高效表達[18］。Gurkan等[19］使用外源基因表達序列優(yōu)化軟件重新設(shè)計外源基因的序列，A+T含量由70%降到50%，可使畢赤酵母高效表達細菌毒素及其衍生產(chǎn)物。

3.1.3 密碼子

外源基因中的密碼子影響外源基因的表達。畢赤酵母表達系統(tǒng)對密碼子具有偏愛性，使用畢赤酵母偏愛的密碼子可使外源基因高效表達。通過對酵母基因使用密碼子的統(tǒng)計分析，確認了61個密碼子中有25個密碼子是酵母所偏愛的[20］。張朝春等[21］根據(jù)人神經(jīng)營養(yǎng)素的基因序列，把編碼氨基酸的密碼子轉(zhuǎn)換成畢赤酵母偏愛的密碼子，結(jié)果表明使用偏愛密碼子的基因在畢赤酵母菌株中的表達明顯優(yōu)越于對照組表達量，在誘導(dǎo)后72～96 h最高，達到31 mg/L左右。Li等[22］根據(jù)外源基因?qū)γ艽a子的偏好性，對硫色曲霉的內(nèi)切β－1，4－木聚糖酶基因改造，表達產(chǎn)量為105 U/mL，是未改造外源基因表達產(chǎn)量的5倍。

3.1.4 基因拷貝數(shù)

基因拷貝數(shù)影響外源蛋白的表達量。多拷貝基因通?？梢蕴岣咄庠椿虻谋磉_量，外源基因的拷貝數(shù)越多，外源蛋白的表達量也就越高。利用畢赤酵母表達肝炎B表面抗原(HbsAg)時發(fā)現(xiàn)，包含4個基因拷貝的菌株的表達量是單拷貝菌株表達量的4倍，而且對于轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響[23］。Li等[24］增加畢赤酵母中的脂肪酸去飽和酶與延長酶基因的拷貝數(shù)，提高花生四烯酸和十二碳五烯酸產(chǎn)物的含量。然而有時增加外源基因的拷貝數(shù)有可能會降低蛋白的表達量。由于資源和能量的限制，增加基因拷貝數(shù)可能對轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生影響，這也會限制外源蛋白的表達。還可能是由于高拷貝使菌株穩(wěn)定性減弱，也可能與外源基因自身特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)。對于分泌效率低的蛋白，過高的表達對畢赤酵母分泌途徑產(chǎn)生負反饋抑制作用，不利于外源蛋白的表達。因此在選擇表達菌株時不能僅僅追求高拷貝數(shù)，應(yīng)以蛋白表達量為最終的標(biāo)準(zhǔn)篩選高表達菌株。

3.2 培養(yǎng)條件

3.2.1 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為酵母細胞生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，在培養(yǎng)基中添加適量的酪蛋白氨基酸和蛋白胨等，能夠緩解蛋白酶對外源蛋白的水解作用，同時提供蛋白合成和分泌的原料和能量，有利于增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性，提高外源蛋白的表達量。這些物質(zhì)可能是通過替代或競爭蛋白酶起作用，抑制蛋白酶的活性[25］。在培養(yǎng)基中添加一些特殊的營養(yǎng)物質(zhì)，如含有金屬的酶、金屬元素等，能提高一些特殊蛋白的表達水平。在培養(yǎng)基中加入特異的蛋白酶抑制劑能很好地抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白的表達。Shi等[26］在培養(yǎng)基中加入絲氨酸和天冬氨酸蛋白酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)蛋白酶活性分別降低了53%和30%。

3.2.2 溫度

畢赤酵母表達外源蛋白的適宜溫度為28℃～30℃，在此溫度范圍畢赤酵母細胞生長速度最快，理論上外源蛋白的表達量與菌體密度呈正相關(guān)性。畢赤酵母表達外源蛋白時會產(chǎn)生大量的熱量，當(dāng)溫度超過32℃時，外源蛋白的表達會停止。因此，畢赤酵母表達過程中要控制合適的溫度。研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母在較低溫度下有利于外源蛋白的表達，可能是外源蛋白在較高溫度下的穩(wěn)定性下降，不利于蛋白質(zhì)折疊，也可能是死細胞釋放更多的蛋白酶降解外源蛋白[27］。Li等[28］用畢赤酵母表達鯡魚防凍蛋白時發(fā)現(xiàn)，低溫顯著增加了外源蛋白的表達量，可能是由于低溫條件下增強了蛋白折疊通路和細胞生存能力。

3.2.3 pH 值

畢赤酵母能夠在一個較寬的pH值范圍內(nèi)生長(3.0～7.0)。pH值通過影響蛋白酶活性，改變蛋白酶對外源蛋白的降解作用，來影響外源蛋白的表達量和活性。不同的外源蛋白穩(wěn)定表達需要不同pH值。重組的小鼠表皮因子和人血清蛋白表達的最適pH值為6.0[29］，而類胰島素生長因子Ⅰ在pH值為3.0時表達效果最佳。

3.2.4 通氣

畢赤酵母利用甲醇表達外源蛋白時需要消耗大量的氧氣，溶氧不足會抑制菌體繁殖和外源蛋白的表達，并且造成甲醇及次級代謝產(chǎn)物甲醛和過氧化氫的積累，對酵母細胞產(chǎn)生毒害作用，因此充足的通氣量對畢赤酵母外源蛋白的表達極其重要。

3.2.5 甲醇誘導(dǎo)

甲醇是酵母表達的誘導(dǎo)物和唯一的碳源。在甲醇誘導(dǎo)期間，由于甲醇的消耗和揮發(fā)，應(yīng)及時向培養(yǎng)基中連續(xù)補加甲醇。甲醇濃度太高對畢赤酵母細胞產(chǎn)生毒害，濃度太低則誘導(dǎo)表達的外源蛋白太少。一般甲醇的添加量為培養(yǎng)基體積的0.5% ～1%。

甲醇誘導(dǎo)時間也影響外源基因的表達量。誘導(dǎo)時間太短則表達的外源蛋白量少，誘導(dǎo)時間太長外源蛋白容易被蛋白酶降解，外源蛋白的表達量少。因此應(yīng)根據(jù)載體的特點和外源蛋白的性質(zhì)選擇最合適的誘導(dǎo)時間，誘導(dǎo)產(chǎn)生最大量的外源蛋白。

4 結(jié)論

利用畢赤酵母表達外源蛋白是很高效的，通過利用高效的啟動子、分泌信號、抑制蛋白酶活性和發(fā)酵控制等，研究者們已經(jīng)實現(xiàn)了很多外源蛋白的高效表達。一定程度的流程優(yōu)化，有助于產(chǎn)生最大量和最高活性的外源蛋白，而外源蛋白的產(chǎn)量和活性很大程度上依賴培養(yǎng)的參數(shù)，這些可以通過條件控制來滿足[10］。

畢赤酵母表達系統(tǒng)相對于大腸桿菌、釀酒酵母、昆蟲細胞等，是最簡單和最可靠的外源基因表達系統(tǒng)[10］，現(xiàn)已經(jīng)成功表達了細菌、真菌、病毒、植物、動物以及人類方面的相關(guān)蛋白質(zhì)[30］。過去幾十年來，畢赤酵母表達系統(tǒng)在很多外源蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)中已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的大腸桿菌表達系統(tǒng)和釀酒酵母表達系統(tǒng)。但是畢赤酵母表達系統(tǒng)還存在一些不足之處，外源基因在畢赤酵母中的表達和高效表達還需要更多的研究去認識，表達產(chǎn)物與天然蛋白的結(jié)構(gòu)和功能還需要進一步的研究。但是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對畢赤酵母表達系統(tǒng)的研究會更加深入，有理由推測畢赤酵母表達系統(tǒng)將會有更大的發(fā)展和應(yīng)用空間。

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