硝酸鹽還原試驗(yàn)直接檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌耐藥性

張衛(wèi) 劉華 趙文艷 馬延 田艷生

WHO報(bào)道，在2005年，全球有880萬結(jié)核病新發(fā)病例，死亡病例160萬［1］，而且，這種情況隨著艾滋病及耐多藥結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)的流行而日趨嚴(yán)峻［1-3］。監(jiān)測MTB耐藥性是控制耐多藥菌株流行的有效方法之一，然而，目前所用方法，受到檢測費(fèi)用高和檢測時(shí)間長等不利因素的限制，因此，急需發(fā)展快速價(jià)廉的檢測方法。近年來，國外學(xué)者報(bào)道用硝酸鹽還原試驗(yàn)(nitrate reductase assay，NRA)在固體或液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，直接或間接檢測痰標(biāo)本中MTB的耐藥性，大大的縮短了結(jié)果報(bào)告時(shí)間［4-6］。然而，國外對此方面的報(bào)道僅限于1～2種藥物［4-6］，且國內(nèi)此方面的報(bào)道較少，因此，我們應(yīng)用NRA法在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上直接檢測痰標(biāo)本中的MTB對4種一線抗結(jié)核藥物利福平(RMP)、異煙肼(INH)、鏈霉素(S)及乙胺丁醇(EMB)的耐藥性，同比例法結(jié)果進(jìn)行比較，評價(jià)該方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 156份涂陽痰標(biāo)本(≥+)來自華北石油總醫(yī)院結(jié)核科2009年1月至20011年5月門診及住院患者。

1.2 試劑與儀器 Middlebrook 7H9培養(yǎng)基、OADC(oleic acidalbumin-dextrose-catalase)添加劑、PANTA(polymyxin B，amphotericin B，nalidixic acid，trimethoprim，azlocillin)添加劑均購自美國BD公司;利福平、乙胺丁醇、異煙肼及鏈霉素藥物粉劑(美國Sigma公司);改良羅氏培養(yǎng)基為本室自制;H37RV標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株(中國藥品生物制品檢定所)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理：痰標(biāo)本首先進(jìn)行厚涂片抗酸染色，方法及結(jié)果判定參照文獻(xiàn)［7］。涂陽痰標(biāo)本(≥+)5～10 ml加入50 ml無菌離心管中，加等體積0.5%NaCl-NaOH(0.1 mol/L檸檬酸三鈉50 ml與4%NaOH 50 ml混合后滅菌，用前向混合液中加入0.5 g NaCl粉劑，24 h內(nèi)使用)溶液，漩渦震蕩混勻1 min，室溫消化15 min，加磷酸鹽緩沖液(pH值6.8)至50 ml混勻，5 000 r/min離心20 min，棄上清，再加磷酸鹽緩沖液重懸沉淀物至2.5 ～3 ml。

1.3.2 標(biāo)本接種：參照文獻(xiàn)［4-6］，Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基(每支4.6 ml)用前加入0.5%甘油、10%OADC、0.2%PANTA和1 000μg/ml NaNO3，取處理后混懸液0.4 ml分別加入4支含藥Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基(各含藥培養(yǎng)基終濃度為RMP 2.0 μg/ml、INH 0.2 μg/ml、S 1.0 μg/ml、EMB 5.0μg/ml)，另取1∶10稀釋后混懸液0.4 ml加入1支不含藥Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基為對照管，均置37°C培養(yǎng)。

1.3.3 NRA試驗(yàn)：參照文獻(xiàn)［8］，取0.2 ml新鮮配置的硝酸鹽還原試劑(一份50%濃鹽酸，2份0.2%氨基苯磺胺，2份0.1%N-甲萘基乙烯二胺鹽酸鹽)加至培養(yǎng)5 d后的1 ml不含藥對照培養(yǎng)基中，無顏色變化為陰性，有顏色變化為陽性(+～++++，粉紅～深紅～紫紅)。如對照培養(yǎng)基陰性，繼續(xù)孵育至7、10、14、18 d(終止)重復(fù)試驗(yàn)。INH、S和 EMB 結(jié)果判定：如含藥培養(yǎng)基顏色變化相同或大于1∶10稀釋的不含藥對照培養(yǎng)基，判定為耐藥，如無顏色變化或顏色變化小于1∶10稀釋的不含藥對照管，判定為敏感。RMP結(jié)果判定：如含藥培養(yǎng)基有顏色變化判定為耐藥，無顏色變化判定為敏感。每支陽性管取2滴混懸液接種血瓊脂培養(yǎng)基，37℃，孵育48 h后排除其他細(xì)菌污染。

1.3.4 比例法藥敏試驗(yàn)：取上述標(biāo)本處理后混懸液0.1 ml，分別接種2支改良羅氏培養(yǎng)基，以下步驟按中國防癆協(xié)會制定的“結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程”［7］，藥物濃度：RMP(40 μg/ml)、INH(0.2 μg/ml)、S(4 μg/ml)、EMB(2 μg/ml)。

1.3.5 質(zhì)控：用H37RV標(biāo)準(zhǔn)敏感株為質(zhì)控菌株。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，NRA性能觀察指標(biāo)用敏感度和特異度表示，兩種方法的一致性分析用kappa檢驗(yàn)：＜0.2為微弱;0.21～0.4為弱;0.41～0.6為適中;0.61～0.8為顯著;0.81～1.0為極佳。

2 結(jié)果

2.1 NRA法成功情況 156份痰標(biāo)本中，有124份(79.5%)成功的進(jìn)行了NRA檢測，32份標(biāo)本無效(20.5%)。124份有效標(biāo)本抗酸染色結(jié)果為：1+標(biāo)本21份(16.9%)，2+標(biāo)本42份(33.9%)，3+標(biāo)本36份(29.0%)，4+標(biāo)本25份(20.2%)。32份無效標(biāo)本中有11份標(biāo)本(7.1%)污染，21份標(biāo)本(13.4%)在18天時(shí)陰性，抗酸染色結(jié)果為：1+標(biāo)本16份(10.3%)，2+標(biāo)本3份(1.9%)，3+標(biāo)本1份(0.6%)。

2.2 NRA法和比例法結(jié)果獲取時(shí)間比較 NRA結(jié)果在5 d獲得3份(2.4%)，7 d獲得 23份(18.5%)，10 d獲得 51份(41.1%)，14 d獲得38份(30.6%)，18 d獲得 9份(7.3%)，62.1%的結(jié)果可在10 d獲得，結(jié)果平均獲得時(shí)間為11.1 d。比例法結(jié)果在14 d獲得5份，21 d獲得21份，28 d獲得45份，35 d獲得34份，49 d獲得19份，結(jié)果平均獲得時(shí)間為31.4 d。兩種方法的結(jié)果獲取時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 NRA法和比例法檢測結(jié)果比較 以比例法結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，NRA法檢測MTB對RMP、INH、S、EMB的耐藥性有很好的敏感度(100%、100%、90%、94.3%)和特異度(98.8%、98.9%、96.0%、96.8%)，一致性kappa檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，有極佳的一致性(0.98、0.98、0.91、0.92)。見表 1。

表1 NRA法和比例法直接檢測痰標(biāo)本中MTB耐藥性結(jié)果比較

3 討論

目前檢測MTB耐藥性的標(biāo)準(zhǔn)方法有基于羅氏培養(yǎng)基的比例法、絕對濃度法、耐藥比率法、微放射法(BACTEC-460系統(tǒng))等。然而，這些方法不是耗時(shí)太長，就是產(chǎn)生放射性廢物，基層醫(yī)院很難推廣，目前的商業(yè)方法，如 MTB生長指示管法(MGIT)、分子方法，雖然快速，但價(jià)格昂貴，也不適用于基層醫(yī)院。而基層醫(yī)院是控制耐多藥MTB流行和傳播的重點(diǎn)，因此，我們參照國外學(xué)者的研究，用NRA法直接檢測痰標(biāo)本中的MTB對四種一線抗結(jié)核藥物的耐藥性，結(jié)果顯示NRA法有很好的敏感度和特異度，同比例法結(jié)果有很好的一致性，同國外報(bào)道［4-6］相符。

MTB可在液體培養(yǎng)基中快速生長，但用液體培養(yǎng)基從臨床標(biāo)本(如痰)中直接檢測MTB的耐藥性時(shí)，易受到雜菌的污染，培養(yǎng)基中加入抗菌素，可減少或防止污染，這種方法已成功應(yīng)用于BACTEC-460檢測系統(tǒng)和MGIT法，在本研究中，我們使用PANTA抗菌素混合液，污染率為7.1%，同國外報(bào)道［4-6］相符。我們還觀察到，污染的培養(yǎng)基大多為INH、S、EMB含藥管，硝酸鹽還原試驗(yàn)仍為陽性，RMP含藥管污染較少，說明大多數(shù)污染菌對RMP敏感，提示應(yīng)仔細(xì)檢查耐藥的標(biāo)本，耐藥標(biāo)本應(yīng)接種血瓊脂培養(yǎng)基排除其它雜菌污染。

NRA法直接用于涂陽痰標(biāo)本耐藥性測定，不僅可用于痰菌較多的標(biāo)本，也可用于痰菌較少的標(biāo)本，我們的結(jié)果顯示，可用于NRA直接檢測的痰標(biāo)本50.8%為+～++。在本研究中，我們囑患者留取痰標(biāo)本時(shí)，一定要清晨漱口后咳深部痰，一方面要保證標(biāo)本質(zhì)量，另一方面，標(biāo)本量要適中(5～10 ml)，保證MTB在培養(yǎng)基中適量，而非過量生長。在本研究中，NRA法直接檢測痰標(biāo)本中MTB耐藥性成功率為79.5%，同國外報(bào)道［4］相符。用NRA法檢測無效的標(biāo)本在改良羅氏培養(yǎng)基上亦未生長，且主要為痰菌+標(biāo)本，分析為標(biāo)本中MTB含量較少，或因抗結(jié)核藥物作用而使涂片所見的MTB多數(shù)已喪失生命力［9］。

有1份標(biāo)本兩種方法的INH、RMP和S結(jié)果均有差異，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果同前，NRA法對INH、RMP、S耐藥，比例法結(jié)果卻均為敏感，此標(biāo)本來自一化療失敗患者，先前曾持續(xù)檢出過耐多藥MTB菌，分析可能該患者痰標(biāo)本中混合有敏感MTB和耐多藥MTB，因耐多藥MTB有時(shí)在改良羅氏培養(yǎng)基上較敏感MTB生長困難，而在添加了OADC的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基上卻生長良好。此外，NRA法檢測RMP和INH耐藥性的敏感度、特異度均高于S和EMB，是否與樣本量及藥物濃度有關(guān)，有待于進(jìn)一步證實(shí)。

在本研究中，我們用市售的OADC添加劑刺激MTB的生長，用PANTA抗菌素混懸液減少污染率，獲得了良好的效果，但這兩種添加劑均為進(jìn)口，增加了檢測費(fèi)用，應(yīng)進(jìn)一步摸索價(jià)廉的，易于獲得的上述兩種添加劑的替代品。本研究結(jié)果表明，NRA法直接檢測痰標(biāo)本中MTB耐藥性快速、簡便、價(jià)廉，靈敏度和特異性較高，且觀察結(jié)果直觀，不需特殊儀器設(shè)備。

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