免疫磁珠法富集沙門氏菌的優(yōu)化及應(yīng)用

山 珊，牛瑞江，賴衛(wèi)華，劉道峰，魏 華，熊勇華

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)，江西南昌330047)

沙門氏菌是自然界普遍存在的一種食源性致病菌，在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病例數(shù)占第一位［1］，常引起人類急性腹瀉、嘔吐、腹部疼痛、高燒和敗血癥等疾?。?］。沙門氏菌危害較大，在2006年歐盟調(diào)查中大約有160049人被確認(rèn)感染了沙門氏菌［3］。2008年4～8月，美國有286人感染，2人死亡［4］。2010年美國因沙門氏菌污染，召回了約5億枚污染雞蛋。2010年在日本4090個農(nóng)場中抽取203個調(diào)查，結(jié)果有48個農(nóng)場顯示陽性，占調(diào)查的23.6%［5］。2012年美國食品和藥品監(jiān)管局(FDA)統(tǒng)計，美國每年大約有400人死于沙門氏菌感染。為了加快沙門氏菌的檢測速度，人們采用免疫磁珠的方法對樣品進(jìn)行富集。王海明等利用英國Matrix公司的Pathetrix免疫磁分離系統(tǒng)進(jìn)行動態(tài)富集，目標(biāo)菌捕獲效率的平均值達(dá)到60%，三種濃度的沙門氏菌添加到8種食品基質(zhì)中，目標(biāo)菌捕獲效率的平均值是23%［6］。張東方等［7］將免疫磁捕獲和實(shí)時熒光PCR技術(shù)結(jié)合起來，16h內(nèi)檢測雞肉中的沙門氏菌，檢測限為104CFU/mL。王曉聞等［8］免疫磁珠捕獲和PCR技術(shù)結(jié)合起來，在7h內(nèi)檢測了牛乳中的沙門氏菌，檢測靈敏度為9CFU/mL。然而，目前未見采用免疫磁珠法對多種代表性的沙門氏菌進(jìn)行系統(tǒng)研究的文獻(xiàn)報道。本文專注于免疫磁富集的研究，較為系統(tǒng)地優(yōu)化了沙門氏菌抗體與磁珠的多種偶聯(lián)條件和免疫磁珠捕獲工藝，用所制備的免疫磁珠對鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、鴨沙門氏菌和腸炎沙門氏菌五種具有代表性的沙門氏菌進(jìn)行富集，并在食品基質(zhì)中得到應(yīng)用。本方法特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高，使用方便，結(jié)合前端的選擇性增菌和后端的免疫層析分析，可以建立起完整的沙門氏菌快速檢測系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬霍亂沙門氏菌(ATCC 10708)、甲型副傷寒沙門氏菌(ATCC 9150)、(鴨沙門氏菌ATCC 9150)、腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)、鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 13311)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(CMCC 54001)、大腸埃希氏菌(O157∶H7 CMCC 44828)、金黃色葡萄球菌(CMCC 26003) 均為本實(shí)驗(yàn)室保存;沙門氏菌多克隆抗體 本實(shí)驗(yàn)室制備;溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;MES Alafa公司;EDC、NHSS PIERCE公司;SM3-P100磁珠、PM3-020磁珠 上海奧潤微納新材料科技有限公司。

BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜 蘇州安泰;ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠;TGL-16臺式離心機(jī) 湖南湘儀;日立H-7500型透射電鏡HITACHI;NICOMP380/ZLS型納米粒度分析儀 英國PSS粒度分析儀公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兔抗沙門氏菌免疫磁珠的制備及優(yōu)化 取少量磁珠到離心管中，磁分離后棄上清，乙醇清洗后用PBS溶液調(diào)磁珠到合適濃度，超聲處理，采用透射電鏡觀察磁珠的形狀、大小和表面形態(tài)等特征。用活潑酯法將PM3-020磁珠表面的羧基活化，加入一定量的純化后的兔抗沙門氏菌抗體［9］，其中磁珠用量分別取 0.05、0.2、0.4、0.5、1.0mg，抗體添加量分別取 10、20、30、50、75、100μg。將沙門氏菌接種到 LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用平板涂布計數(shù)法計數(shù)后，再經(jīng)濃度梯度稀釋將菌液濃度調(diào)整為105CFU/mL。不同條件的免疫磁珠與相同濃度的菌懸液均勻混合，用0.1%蛋白胨水定容至1mL。室溫孵育45min，轉(zhuǎn)速30r/min，磁力架分離3min，取上清，用磷酸鹽緩沖液清洗兩次，將分離出來捕獲有沙門氏菌的免疫磁珠、上清液和洗脫液采取合適的梯度，進(jìn)行菌落計數(shù)［10］，每個梯度三個平行，所有的平板培養(yǎng)溫度為(37±1)℃，時間為18～24h。通過平板計數(shù)法計算菌液的濃度，計算其捕獲效率，免疫磁珠的捕獲效率公式如下:

捕獲效率(%)=磁珠捕獲菌落總數(shù)/(磁珠捕獲菌落總數(shù)+上清液中菌落總數(shù)+洗滌液中菌落總數(shù))×100

1.2.2 免疫磁珠捕獲工藝的優(yōu)化 分別對免疫磁珠捕獲過程中的菌濃度、反應(yīng)時間、磁分離時間、磁場強(qiáng)度以及不同粒徑大小磁珠進(jìn)行優(yōu)化。所選的菌濃度為 106、105、104、103、102CFU/mL;免疫磁珠與菌液的反應(yīng)時間為10、30、45、60min;磁分離時間設(shè)為1、3、5、7min;再磁分離時采用磁場強(qiáng)度分別為 0.4、0.8、1.5T的磁分離器進(jìn)行比較;取180和1150nm粒徑的免疫磁珠與105CFU/mL濃度的菌懸液均勻混合，比較捕獲效率。

1.2.3 免疫磁珠在雜菌體系中捕獲效率的比較 將鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌分別接種到LB中培養(yǎng)，將雜菌濃度調(diào)整為大約106CFU/mL后，取1mL菌液與免疫磁珠混合。孵育、磁分離，取上清，清洗兩次，采用固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.2.4 不同菌屬捕獲效率比較 將鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鴨沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌活化后分別接種到LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，將菌液濃度調(diào)整為大約105CFU/mL后，取1mL菌液與免疫磁珠混合。孵育、磁分離，取上清，清洗兩次，采用固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.2.5 免疫磁珠在實(shí)際樣品中富集 稱取牛奶和雞蛋樣品25g或25mL，加入到225mL BPW中，接種一定濃度的沙門氏菌，(36±1)℃，時間為8～18h。取1mL菌液與免疫磁珠混合。孵育、磁分離后，取上清，清洗兩次，采用固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 透射電鏡表征

從圖1中透射電鏡照片可以看出，奧潤PM3-020磁珠外觀成球性較好，球體表面均勻，無雜質(zhì)粘連，放大倍數(shù)為35.0×1000。從圖2可得，磁珠偶聯(lián)抗體前平均粒徑為194.3nm，粒徑分布較窄，多分散指數(shù)(PDI)為0.104，分散性好;磁珠偶聯(lián)抗體后所得免疫磁珠的平均粒徑為215nm，多分散指數(shù)(PDI)為0.163;免疫磁珠BSA封閉后的平均粒徑為256.1nm，多分散指數(shù)(PDI)為0.189。

圖1 羧基磁珠透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 TEM of carboxylated magnetic nanobeads

圖2 磁珠粒徑變化圖Fig.2 Changes of magnetic beads size distribution

2.2 偶聯(lián)抗體不同添加量結(jié)果和免疫磁珠工作濃度的確定

從圖3可以看出，在制備免疫磁珠時，當(dāng)抗體的濃度小于50μg/mg時，羧基化磁珠對抗體的吸附量隨著抗體質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)抗體的質(zhì)量濃度大于50μg/mg，羧基化磁珠對抗體的吸附量反而會下降。實(shí)驗(yàn)可得出抗沙門氏菌抗體中的飽和吸附量是50μg/mg。當(dāng)免疫磁珠的量增加到0.4mg時，捕獲效率基本保持穩(wěn)定。磁珠是通過抗原抗體特異性結(jié)合來捕獲菌，當(dāng)菌的表面結(jié)合了足夠量的磁珠時，再加入磁珠，菌的捕獲量幾乎不會有太明顯的提高，所以選擇0.4mg為最佳添加量。

圖3 偶聯(lián)抗體不同量以及免疫磁珠不同添加量捕獲效率比較Fig.3 Comparison of the capture efficiency of different amount of antibody with the same bead and different magnetic immunobeads concentration

2.3 免疫磁珠捕獲不同菌濃度結(jié)果和免疫磁珠與菌液最佳反應(yīng)時間結(jié)果

從圖4中可看到，比較不同菌濃度在純培養(yǎng)體系中的捕獲效率，菌液濃度為102～106CFU/mL，捕獲效率為65%～82%，說明捕獲效率比較穩(wěn)定。磁珠的添加量是固定不變的，隨著菌液濃度的增加而捕獲效率降低的趨勢比較小，這說明磁珠的濃度已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)。

在比較孵育時間圖中可看到，從左至右的捕獲效率分別為32.7%、45.9%、72%、73.2%。磁珠與菌液共孵育的時間越長，捕獲效果越好，但是當(dāng)孵育時間大于45min，效果就不明顯了。結(jié)果說明孵育45min為最佳孵育時間。

圖4 不同菌濃度捕獲效率比較以及不同孵育時間捕獲效率比較Fig.4 Comparison of the capture efficiency of different concentration of Salmonella with the same bead concentration and the capture dynamics charts of different immuno-reaction time

2.4 磁分離最佳時間、磁場強(qiáng)度和磁珠直徑的確定結(jié)果

從圖5可看到，在免疫磁分離圖表中從左至右捕獲效率分別為60.3%、83.2%、81.5%、78.3%。捕獲效率隨著時間延長到3min時達(dá)到最高，時間再延長捕獲效率反而降低，說明3min為最佳磁分離時間。

在不同磁場強(qiáng)度的比較圖中，磁場強(qiáng)度分別為0.4、0.8、1.5T，當(dāng)磁分離時間是 3min時，磁場強(qiáng)度對捕獲效率影響不明顯，免疫磁珠添加量為0.4mg，孵育時間45min，捕獲效率分別為57.39%、60.76%和63.74%。從安全考慮選擇0.8T的磁分離器。

分別選用 PM3-020(180nm)和 SM3-P100(1150nm)粒徑的免疫磁珠在純培養(yǎng)體系中捕獲目的菌，從不同磁珠直徑比較的圖中可看出，兩種不同粒徑的磁珠捕獲時磁珠添加量為0.4mg、孵育時間為45min、磁分離時間為3min，捕獲效率分別為65.8%和31.2%，結(jié)果說明在純培養(yǎng)體系中納米磁珠優(yōu)于微米磁珠。

圖5 不同磁分離時間、磁場強(qiáng)度和磁珠直徑捕獲效率比較Fig.5 Comparison of the capture efficiency of different immunomagnetic separation time and different food matrix and different size beads with the same bead concentration

2.5 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖6可見，目的菌中分別添加106CFU/mL的大腸桿菌O157∶H7、106CFU/mL的單核增生李斯特CMCC 54007和106CFU/mL的金黃色葡萄球菌CMCC26003，目的菌捕獲效率分別為51.9%、56.4%、60.1%，雜菌捕獲效率為5.6%、1.77%、1.06%，雜菌的捕獲效率低，結(jié)果說明免疫磁珠的特異性好，雜菌的干擾少。

圖6 特異性實(shí)驗(yàn)Fig.6 Specificity Test

2.6 對不同菌屬捕獲效率結(jié)果和食品基質(zhì)結(jié)果分析

將免疫磁珠分別捕獲鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium，S.T)、豬霍亂沙門氏菌(SalmonellaCholeraesuis，S.C)、甲型副傷寒沙門氏菌(SalmonellaParathpyiA，S.P)、鴨 沙 門 氏 菌(SalmonellaAnatum，S.A)和腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteritidis，S.E)，捕 獲 效 率 分 別 為61.4% 、45.8% 、48.2% 、78.5% 、64.1% 。

由圖7可知，純培養(yǎng)、蛋清、蛋黃和牛奶基質(zhì)的捕獲效率分別為68.3%、44.3%、43.2%、65.2%。在牛奶基質(zhì)中捕獲效率65.2%接近純培養(yǎng)捕獲效率68.3%，說明牛奶基質(zhì)對捕獲目的菌的干擾小;在蛋清和蛋黃基質(zhì)中捕獲效率為44.3%和43.2%，與純培養(yǎng)捕獲68.3%有一定差距，說明蛋清和蛋黃基質(zhì)對捕獲目的菌的干擾較大。

圖7 不同菌株和不同食品基質(zhì)捕獲效率比較Fig.7 Comparison of the capture efficiency of different strain and different food matrix with the same bead concentration

3 結(jié)論與討論

制備捕獲效率高的免疫磁珠時，選擇粒徑均勻的磁珠是制備免疫磁珠的一個重要前提，影響磁珠性能的因素有粒徑大小、顆粒分散性、表面修飾基團(tuán)分布、磁響應(yīng)性、沉降速度等［11］。為了更好地提高磁珠的生物相容性和生物特異性，實(shí)驗(yàn)中采用交聯(lián)劑將特異性抗體氨基與表面修飾有羧基的納米磁珠偶聯(lián)，偶聯(lián)過程中，EDC起到活化磁珠表面羧基的作用，反應(yīng)形成活潑酯，由于生成的活潑酯在溶液中不穩(wěn)定易水解，為此立即加入NHSS(N-羥基硫代琥珀酰亞胺)，生成穩(wěn)定的NHSS酯，同時達(dá)到活化羧基的目的，活化好的磁珠與抗體的氨基共價反應(yīng)生成免疫磁珠［12］。整個制備過程包括活化、偶聯(lián)、封閉與保存四個過程，在偶聯(lián)過程中有時出現(xiàn)磁珠絮集沉降現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)采取超聲進(jìn)行分散，起到了很好的效果，得到分散性好的免疫磁珠。

國外商品化的免疫磁珠大多數(shù)是微米級的，微米級的免疫磁珠由于磁性較強(qiáng)，在大體系動態(tài)富集過程中有一定的優(yōu)勢。本研究為小體系靜態(tài)富集過程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米級免疫磁珠(180nm)的捕獲效率優(yōu)于微米級免疫磁珠(1150nm)。沙門氏菌表面結(jié)合磁珠的容量取決于兩個參數(shù)，一是沙門氏菌表面(直徑為0.5μm，長度為2μm)具有的抗原表位數(shù)量，另一個則取決于磁珠的體積大小。由于空間位阻的原因，磁珠體積大，磁珠與細(xì)菌可結(jié)合的位點(diǎn)將減少;磁珠體積小，磁珠與細(xì)菌表面可結(jié)合的量增加。當(dāng)磁珠直徑為200nm左右時，細(xì)菌表面可結(jié)合的磁珠量最大可能是100個左右，因此可以連接較多的免疫磁珠，從而細(xì)菌可以有效地被捕獲;而微米級磁珠，由于空間位阻的原因，細(xì)菌表面與磁珠的結(jié)合位點(diǎn)下降為只有幾個，細(xì)菌不容易被免疫磁珠所捕獲。

［1］M Manzano，L Cocolin，G Astori，et al.Development of a PCR microplate-capture hybridization method for simple，fast and sensitive detection of Salmonella serovars in food［J］.Molecular and Cellular Probes，1998，12(4):227-234.

［2］Yongcheng Liua，Yihua Che，Yanbin Li.Rapid detection of Salmonella typhimurium using immunomagnetic separation and immuno-optical sensing method［J］.Sensors and Actuators B，2001，72(3):214-218.

［3］Noelle Mccarthy，F(xiàn) Jerry Reen，James F Buckley，et al.Sensitive and Rapid Molecular Detection Assays for Salmonella enterica Serovars Typhimurium and Heidelberg［J］.Journal of Food Protection，2009，72(11):2350-2357.

［4］Li Ma，Guodong Zhang，Peter Gerner-Smid，et al.Survival and Growth of Salmonella in Salsa and Related Ingredients［J］.Journal of Food Protection，2010，73(3):434-444.

［5］Eriko Iwabuchi，Noriko Maruyama，Ayumi Hara，et al.Nationwide Survey of Salmonella Prevalence in Environmental Dust from Layer Farms in Japan［J］.Journal of Food Protection，2010，73(11):1993-2000.

［6］王海明，俞曉，金燕飛，等.應(yīng)用磁免疫技術(shù)快速檢測食源性沙門氏菌方法研究［J］.中國衛(wèi)生監(jiān)督雜志，2009，16(1):36-39.

［7］張東方，袁飛，王娉，等.免疫磁捕獲-實(shí)時熒光PCR快速檢測雞肉中沙門氏菌［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(8):142-147.

［8］王曉聞，楊永莉.免疫磁珠捕獲-PCR檢測牛乳中沙門氏菌的研究［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，29(4):289-294.

［9］牛瑞江，賴衛(wèi)華，熊齊榮，等.鼠傷寒沙門氏菌特異性多克隆抗體的純化方法［J］.食品科學(xué)，2011，32(13):151-155.

［10］徐金亭，李志清，向軍儉，等.單增李斯特菌免疫磁珠的制備研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(5):323-327.

［11］劉輝榮.免基于納米磁性微球的免疫層析定量檢測技術(shù)研究［D］.上海:上海交通大學(xué)，2008.

［12］徐金亭.免疫磁珠的制備及其富集、分離單增李斯特菌的研究［D］.廣州:暨南大學(xué)，2011.