呋喃它酮代謝物5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮單克隆抗體的制備、鑒定與膠體金免疫層析試紙條的研制

張曉麗，顏 露，向軍儉，鄒軍輝，唐 勇

(廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，暨南大學(xué)抗體工程中心，廣東廣州510632)

呋喃它酮屬于硝基呋喃類抗生素藥物，曾被廣泛應(yīng)用于家禽、家畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖等的傳染病預(yù)防與治療，具有良好的抗球蟲及抗菌作用［1］。但原藥及其代謝物5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)具有相當(dāng)大的毒性與副作用，能致突變、畸胎、誘發(fā)癌癥［2］。1995年起歐盟、美國(guó)、加拿大等開始禁止在食用性畜禽及水產(chǎn)動(dòng)物中使用硝基呋喃類藥物，且規(guī)定殘留標(biāo)準(zhǔn)為不得檢出。2002年起我國(guó)也將硝基呋喃類藥物列為禁用獸藥，規(guī)定動(dòng)物源性食品中不得檢出該類藥物。呋喃它酮原藥在生物體內(nèi)代謝迅速，難以直接檢測(cè)［3］，而其代謝產(chǎn)物AMOZ可與蛋白質(zhì)結(jié)合，在生物體內(nèi)穩(wěn)定存在數(shù)月。因此，可以通過檢測(cè)體內(nèi)AMOZ水平來達(dá)到檢測(cè)呋喃它酮原藥殘留的目的。目前常用的檢測(cè)呋喃它酮及AMOZ的方法多為分析儀器法，如HPLC、HPLC-MS/MS，UHPLCMS/MS 等［4-7］，該類方法檢測(cè)準(zhǔn)確、靈敏，但需要輔助大型檢測(cè)儀器，對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)技術(shù)要求較高，因而不太適應(yīng)基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工作的需要。免疫學(xué)檢測(cè)方法的發(fā)展，為呋喃它酮及AMOZ的檢測(cè)提供了一種更簡(jiǎn)便的手段。Pimpitak［8］等用制備得到的AMOZ單克隆抗體建立了檢測(cè)蝦中AMOZ殘留的競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，最低檢測(cè)限達(dá)0.16μg/L。國(guó)內(nèi)檢測(cè)呋喃它酮及AMOZ的相關(guān)報(bào)道多是利用現(xiàn)成的免疫檢測(cè)試劑盒來檢測(cè)某樣品如水產(chǎn)品［9］、雞肉［10］中 AMOZ的殘留，其方法靈敏度可達(dá)0.1μg/L。膠體金免疫層析技術(shù)是上世紀(jì)80年代初期出現(xiàn)的一種快捷的檢測(cè)方法，對(duì)操作人員無技術(shù)要求，適合基層使用。而國(guó)內(nèi)外并沒有有關(guān)AMOZ的膠體金試紙條的研制的報(bào)道。本研究旨在制備高特異性的AMOZ單克隆抗體，并建立膠體金免疫側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)AMOZ進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BALB/c小鼠，6～8周齡，雌性 南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;AMOZ、對(duì)醛基苯甲酸、弗氏完全佐劑、不完全佐劑、PEG 2000、BSA、氯金酸 sigma公司;NHS、DCC pierce公司;Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)室自存;羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗鼠IgG 鼎國(guó)公司;NC膜 Millipore;PVP底板、聚酯膜、玻璃纖維 上海金標(biāo);細(xì)胞培養(yǎng)板 Greiner公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱 Thermo Labsystem;點(diǎn)膜儀、切條機(jī) 上海金標(biāo)科技有限公司;UV-2550紫外分光光度計(jì) 日本 SHIMADZU公司;低溫離心機(jī) eppendorf。

1.2. 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗原的合成及鑒定 半抗原CP-AMOZ的合成:將3mL 13.4g/L的AMOZ溶液緩慢加入1mL濃度為45g/L 4-CBA溶液中，攪拌反應(yīng)1h。過濾收集沉淀，水洗三次，50℃烘干得白色粉末CP-AMOZ。取少量溶于甲醇，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)進(jìn)行鑒定。

免疫抗原CP-AMOZ-BSA的合成:CP-AMOZ，NHS，DCC 均稱取 0.1mmol，溶于 1mL DMF 中，室溫下攪拌反應(yīng)過夜，離心收集上清。稱取70mg BSA溶于4mL PBS，然后加入上清溶液中，4℃攪拌反應(yīng)過夜，離心收集上清。PBS透析3d，冷凍干燥，-20℃保存?zhèn)溆?。檢測(cè)抗原CP-AMOZ-OVA同法制備。SDS-PAGE、紫外光譜掃描鑒定完全抗原合成效果。

1.2.2 單克隆抗體的制備

1.2.2.1 動(dòng)物免疫 取5只6～8周齡雌性健康BALB/c小鼠，首次免疫將CP-AMOZ-BSA與等體積弗氏完全佐劑混合，頸背部皮下多點(diǎn)注射，100μg/只。其后每間隔14d，免疫原與等量不完全佐劑混合再次免疫，共3次。融合前 3d，腹腔注射 100μg/只 CPAMOZ-BSA，加強(qiáng)免疫。

1.2.2.2 細(xì)胞融合與陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選 參照常規(guī)細(xì)胞融合方法，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合［12］。

以50μg/L檢測(cè)抗原CP-AMOZ-OVA包被微孔板，CP-AMOZ作為競(jìng)爭(zhēng)物進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選。選擇抑制率較高，細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好的陽性孔進(jìn)行亞克隆，待細(xì)胞陽性率達(dá)100%后擴(kuò)大培養(yǎng)，建株并凍存。

1.2.2.3 腹水型抗體的制備及純化 采用小鼠體內(nèi)誘生法［13］制備腹水型抗體。飽和硫酸銨沉淀法純化腹水抗體，BCA試劑盒測(cè)定其蛋白含量。

1.2.3 單克隆抗體的鑒定

1.2.3.1 抗體效價(jià)與CP-AMOZ敏感性的測(cè)定 以50μg/L CP-AMOZ-OVA包被，間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。

采用方陣滴定［14］確定最適抗原包被濃度及抗體反應(yīng)濃度，建立間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA法，測(cè)定抗體對(duì)CP-AMOZ的半抑制濃度(IC50)，以 IC50衡量抗體敏感度。

1.2.3.2 抗體特異性分析 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)抗體與其他幾種硝基呋喃類代謝物及其衍生物的交叉反應(yīng)性，計(jì)算各自的IC50及交叉反應(yīng)率:

交叉反應(yīng)率(CR，%)=IC50(CP-AMOZ)/IC50(其他)×100

1.2.4 膠體金試紙條的研制

1.2.4.1 膠體金顆粒的制備與鑒定 取干凈的250mL的錐形瓶，加入100mL 0.01%氯金酸溶液，攪拌加熱至沸騰，迅速加入1%的二水合檸檬酸三鈉2mL，繼續(xù)煮沸10min。溶液冷卻后4℃下保存?zhèn)溆谩２捎米贤夥止夤舛扔?jì)及透射電鏡檢測(cè)金顆粒的粒徑及均勻度。

1.2.4.2 抗CP-AMOZ單克隆抗體的膠體金標(biāo)記取制備的膠體金溶液10mL，用0.25mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié) pH至 8.5，攪拌均勻;加入 0.15mg抗CP-AMOZ單克隆抗體，繼續(xù)攪拌反應(yīng)20min;逐滴加入10mL 5g/L BSA攪拌反應(yīng)25min;12000r/min離心15min，棄上清液;加入1mL含1g/L BSA、0.05g/L疊氮化鈉pH8.5的0.05M Tris-HCl溶液使金-抗體復(fù)合物重懸，2μL/cm噴于聚酯膜結(jié)合墊上。

1.2.4.3 樣品墊預(yù)處理 用含1g/L BSA、1g/L海藻糖、0.02g/L疊氮化鈉和0.1g/L Tween-20的pH7.4，0.015M PBS溶液浸泡玻璃纖維樣品墊，室溫干燥12h后備用。

1.2.4.4 檢測(cè)線、對(duì)照線蛋白包被 將CP-AMOZBSA和羊抗鼠IgG分別稀釋至0.03、0.08g/L，用點(diǎn)膜儀以1μL/cm噴于NC膜上，分別作為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，37℃干燥48h備用。

1.2.4.5 試紙條的組裝 將樣品墊、膠體金墊、NC膜與吸水紙按圖1所示粘貼于PVC底板后，用切割機(jī)切成0.44mm寬的紙條，裝入卡殼內(nèi)。

圖1 膠體金試紙條結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure chart of Test strip

1.2.5 試紙條靈敏度測(cè)試 配置不同濃度的CP-AMOZ溶液滴加于膠體金試紙條加樣孔上，3～5min后肉眼觀察結(jié)果。以T線肉眼完全不可見時(shí)最低濃度的CP-AMOZ濃度為該試紙條靈敏度。

1.2.6 試紙條交叉性實(shí)驗(yàn) 將硝基呋喃類藥物代謝物 SEM、AHD、AOZ和 AMOZ及其相應(yīng)衍生物CP-SEM、CP-AHD及CP-AOZ溶液滴加到試紙條加樣孔上，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗原的鑒定

2.1.1 半抗原的鑒定 從圖2～圖3中可以看到［M+H］+m/z為334.4，［M-H］-m/z為 332.5，證明半抗原CP-AMOZ(分子質(zhì)量333)合成成功，且具有較高的純度。

圖2 CP-AMOZ正離子質(zhì)譜圖Fig.2 Positive hydronium mass spectra of CP-AMOZ

圖3 CP-AMOZ負(fù)離子質(zhì)譜圖Fig.3 Negative hydronium mass spectra of CP-AMOZ

2.1.2 完全抗原的鑒定 SDS-PAGE結(jié)果見圖4所示，CP-AMOZ-BSA條帶相對(duì)于BSA條帶，檢測(cè)抗原CP-AMOZ-OVA條帶相對(duì)于OVA條帶出現(xiàn)了滯后。紫外光譜掃描結(jié)果顯示CP-AMOZ-BSA(最大吸收峰291nm)相對(duì)于BSA(最大吸收峰280nm)與CPAMOZ(最大吸收峰294nm)，CP-AMOZ-OVA(最大吸收峰291nm)相對(duì)于OVA(最大吸收峰278nm)與CP-AMOZ在最大紫外特征吸收峰上均發(fā)生了偏移(圖略)。這些結(jié)果表明完全抗原CP-AMOZ-BSA和CP-AMOZ-OVA偶聯(lián)成功。

圖4 AMOZ相關(guān)抗原及載體蛋白SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE patterns of AMOZ corresponding antigens and carrier proteins

2.2 小鼠抗血清效價(jià)及靈敏度測(cè)定

經(jīng)5次免疫，間接ELISA檢測(cè)5只免疫小鼠抗血清效價(jià)均大于1∶80000(結(jié)果未給出)。選取適宜的血清稀釋倍數(shù)，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)。圖5結(jié)果顯示，5只小鼠抗血清均能與CP-AMOZ競(jìng)爭(zhēng)，其中4號(hào)小鼠抗血清抑制曲線的變化斜率(y=-0.259x+1.626)最高，故選擇4號(hào)小鼠進(jìn)行融合。

圖5 間接ELISA測(cè)定小鼠抗血清靈敏度Fig.5 icELISA for sensitivity of antiserum

2.3 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立

經(jīng)細(xì)胞融合，ELISA檢測(cè)篩選，4次亞克隆后獲得1株能穩(wěn)定分泌特異性抗CP-AMOZ單抗的雜交瘤細(xì)胞株1A11D12D11B5。將上述細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、建株并制備腹水型單抗。腹水單抗經(jīng)飽和硫酸銨沉淀，BCA試劑盒檢測(cè)，腹水抗體的蛋白含量為1.2g/L。

2.4 抗CP－AMOZ單克隆抗體的鑒定

2.4.1 抗體效價(jià)測(cè)定 間接ELISA檢測(cè)，1A11D12D11B5株腹水型單抗效價(jià)為1∶1.6×105。

2.4.2 抗體對(duì)CP-AMOZ敏感性的確定 經(jīng)方陣滴定，確定最適抗原包被濃度為5μg/L，最適抗體反應(yīng)濃度為30μg/L。建立間接ELISA法，并繪制其競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖6可見，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈典型的S型。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=-37.43x+47.50計(jì)算得到CP-AMOZ 50%抑制率質(zhì)量濃度為0.86μg/L，10%抑制率質(zhì)量濃度(LOD)約為0.07μg/L。

圖6 CP-AMOZ的競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Representative inhibition curve for CP-AMOZ

2.4.3 抗體特異性分析 表1結(jié)果表明，所制備的腹水單抗僅與CP-AMOZ特異性反應(yīng)，而與其他硝基呋喃類代謝物及其衍生物的交叉反應(yīng)性均小于0.1%。

表1 CP-AMOZ單抗與其他硝基呋喃類代謝物及衍生物的交叉反應(yīng)性Table 1 Cross reactivity of anti-CP-AMOZwith other nitrofuran metabolites

2.5 膠體金試紙條的研制

2.5.1 膠體金顆粒的制備及鑒定 所制備的膠體金顆粒的最大特征吸收峰出現(xiàn)在520nm處，在透射電鏡下金顆粒形狀規(guī)則且分布均勻，其粒徑在20nm左右。

2.5.2 膠體金與單克隆抗體偶聯(lián)前后光譜分析 偶聯(lián)抗體后的膠體金可見光最大吸收峰出現(xiàn)了紅移，說明抗體已偶聯(lián)到膠體金顆粒上(圖8)。

2.5.3 試紙條靈敏度的測(cè)定 當(dāng)?shù)渭覥P-AMOZ標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為2.5、3μg/L時(shí)，試紙條T線未完全消失，但相較于陰性對(duì)照(PBS稀釋液)明顯變淺，呈弱陽性;當(dāng)CP-AMOZ標(biāo)準(zhǔn)品的濃度提高到5μg/L及以上時(shí)，試紙條T線完全消失。因此，將5μg/L定為該膠體金試紙條的靈敏度。

2.5.4 試紙條交叉測(cè)定 將CP-AMOZ試紙條分別檢測(cè)硝基呋喃類藥物代謝物SEM、AHD、AOZ、AMOZ及其相應(yīng)衍生物CP-SEM、CP-AHD及CP-AOZ，結(jié)果顯示該試紙條與最高100ppb的SEM、AHD、AOZ、AMOZ及其相應(yīng)衍生物 CP-SEM、CP-AHD及CP-AOZ均無交叉反應(yīng)，說明該試紙條特異性良好。

圖7 膠體金顆粒的透射電鏡圖(×135000)Fig.7 The size of naked colloidal gold observed by TEM(×135000)

圖8 膠體金可見光光譜掃描圖Fig.8 Visible optical spectrum scan

圖9 5膠體金試紙條靈敏度的檢測(cè)Fig.9 The sensitivity of ICA with different CP-AMOZ standards

表2 試紙條與CP-AMOZ和類似物的交叉反應(yīng)性測(cè)定Table 2 Cross-reactivity with CP-AMOZ and analog compounds

3 結(jié)論

3.1 AMOZ分子量?jī)H為201，本身不具備免疫原性，必需將其與大分子載體蛋白相偶聯(lián)成完全抗原，才能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。雖然AMOZ可以通過活性基團(tuán)氨基直接與載體蛋白偶聯(lián)，但其分子結(jié)構(gòu)過于簡(jiǎn)單且在形成的抗原結(jié)構(gòu)中與載體蛋白的空間間隔小，因而無法形成有效的抗原表位刺激動(dòng)物體產(chǎn)生針對(duì)AMOZ的抗體。本研究通過引入偶聯(lián)劑對(duì)醛基苯甲酸，在AMOZ空間結(jié)構(gòu)上增加苯環(huán)，將其衍生為CP-AMOZ，使其更適合作為抗原表位。衍生過程只使用了一種有機(jī)溶劑DMF，且僅需進(jìn)行簡(jiǎn)單的水洗過濾就能得到CP-AMOZ。經(jīng)LC-MS的鑒定，本方法能準(zhǔn)確制備得到半抗原CP-AMOZ，且目標(biāo)產(chǎn)物具有很高的純度，整個(gè)方法簡(jiǎn)單易行。后經(jīng)動(dòng)物免疫獲得高效價(jià)、高靈敏度的抗血清，也說明所合成的人工完全抗原能提供有效的AMOZ抗原表位，具有良好的免疫原性。

3.2 通過抗體特異性分析表明，制備的腹水型單抗與硝基呋喃類其他代謝物及衍生物均表現(xiàn)出較低的交叉反應(yīng)性，僅與CP-AMOZ特異性的結(jié)合。就單抗的效價(jià)和間接ELISA IC50而言，與前期文獻(xiàn)［15］相比都有所提高。

3.3 在單抗的基礎(chǔ)上，成功建立了膠體金免疫層析試紙條，靈敏度達(dá)到5μg/L，樣品前處理完成后只需3～5min即可觀察結(jié)果，傳統(tǒng)儀器法相比具有快速、靈敏、高效等特點(diǎn)，適合現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模篩查。由于單抗對(duì)CP-AMOZ有很高的特異性，所以在樣品前處理的過程中應(yīng)有嚴(yán)格的衍生過程要求，因此需要進(jìn)一步研究樣品前處理的方法，并優(yōu)化試紙條的體系，兩者相配合使該試紙條適合基層推廣使用。

［1］沈小婉，李明元，葉樹德.色譜法在食品分析中的應(yīng)用［M］.北京:北京大學(xué)出版社，1992:172-173.

［2］張仲秋，鄭明.畜禽藥物使用手冊(cè)［M］.北京，農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000:74.

［3］Pawinee Thongsrisomboon，Boonsom Liawruangrath，Saisunee Liawruangrath，et al.Determination of nitrofurans residues in animal feeds by flow injection chemiluminescence procedure［J］.Food Chemistry，2010，123(3)，834-839.

［4］Cooper KM，Mulder PPJ，van Rhijn JA，et al.Depletion of Four Nitrofuran Antibiotics and Their Tissue-bound Metabolites in Porcine Tissues and Determination Using LC-MS/MS and HPLC-UV［J］.Food Additives and Contaminants，2005，22(5):406-414.

［5］TribalatLaure，PaisseOlivier，DessalcesGuy，etal.Advantages of LC-MS-MS compared to LC-MS for the determination of nitrofuran residues in honey analytical and bioanalyticalchemistry［J］ .Analytical and Bioanalytical Chemistry，2006，386(8):2161-2168.

［6］Radovnikovic Anita，Moloney Mary，Byrne Paddy，et al.Detection of banned nitrofuran metabolites in animal plasma samples using UHPLC-MS/MS［J］.Journal of Chromatography B-analytical technologies in the biomedical and life sciences，2011，879(2):159-166

［7］Barbosa Jorge，F(xiàn)reitas Andreia，Mourao Luis Jose，et al.Determination of furaltadone and nifursol residues in poultry eggs by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Journal of agricultual and food chemistry.2012，60(17)，4227-4234.

［8］Umaporn Pimpitak，Songchan Putong，Kittinan Komolpis，et al.Development of a monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for detection of the furaltadone metabolite，AMOZ，in fortified shrimp samples［J］.Food Chemistry，2009，116(3):785-791.

［9］宋琍琍，張曉輝，王揚(yáng)，等.酶聯(lián)免疫法快速測(cè)定水產(chǎn)品中呋喃唑酮、呋喃它酮代謝物［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，20(4):296-299.

［10］蘇憲紅，李永強(qiáng).雞肉中呋喃它酮代謝物(AMOZ)殘留檢測(cè)方法-酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)［J］.河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，25(3):67-70.

［11］P Tijssen.Practice and Theory of Enzyme Immunoassay［M］.Amsterdam:Elsever，1985.

［12］Xiang Junjian，Zhai Yifan，Tang Yong，et al.A competitive indirect enzyme-linked immunoassay for lead ion measurement using mAbs against the lead-DTPA complex［J］.Environmental Pollution，2010，158(5):1376-1380.

［13］Wu Jiangxiang，Zhou QingLing，Xue-ping，et al.Production of monoclonal antibodies against broad bean wilt virus［J］.Journal of Zhejiang University，1999，25(2):247-250.

［14］Jung F，Meyer HD，Hamm RT.Development of a sensitive enzyme-linked immunosorbentaassay for the fungicide fenpropimorph［J］.Agricand Food Chemistry，1989，37:1183-1187.

［15］范國(guó)英，張海棠，楊艷艷，等.呋喃它酮代謝物AMOZ單克隆抗體的制備與免疫學(xué)特性鑒定［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2011，20(6):38-42.