穴位埋線對慢性萎縮性胃炎大鼠血清 CRP 、IL-6 、TNF-α的影響

樊永磊,李素荷,鐘國新,陳 璐,張 璇

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,廣州 510405）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis,CAG）是慢性胃炎的一種分型,病理是固有腺體減少,慢性萎縮性胃炎的病情復(fù)雜,是胃癌前狀態(tài)最常見的一類[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的病因病機多為飲食不節(jié)、勞倦過度、七情失和、表邪入里、脾胃素虛等因素反復(fù)作用,致使脾失健運、胃失和降而發(fā)病[2-3]。本病多為本虛標(biāo)實之證,治療時治本當(dāng)健脾益氣滋陰和胃,標(biāo)實當(dāng)理氣活血平調(diào)寒熱[4]。本研究即通過復(fù)制慢性萎縮性胃炎大鼠模型,觀察慢性萎縮性胃炎炎癥反應(yīng)過程中血清中某些炎性因子的表達(dá),并重點觀察穴位埋線的干預(yù)效應(yīng),為臨床開展針灸治療慢性萎縮性胃炎提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用75只8周齡SD大鼠（由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供,許可證號:SCXK粵2008-0002）,體質(zhì)量180～220 g,采用架式籠養(yǎng),恒溫（20±1）℃,濕度50%～60%,光照、黑暗各12 h交替,自動通風(fēng)8～15次/h條件下飼養(yǎng)。所有動物用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)1 w后,將實驗動物按體質(zhì)量編號,用隨機數(shù)字表法將75只大鼠分為空白組25只、造模組50只。

1.2 主要試劑及用品 1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（MNNG,日本東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn),批號GNGMH）;75%乙醇（安徽安特生物化學(xué)有限公司生產(chǎn),批號1107134101）;4-0醫(yī)用羊腸線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn),批號13M1103）;華佗牌30號1.5寸不銹鋼針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)日期201103）;金雅碘消毒液（珠?；苊郎锟萍加邢薰旧a(chǎn),生產(chǎn)日期20110613）;10%中性緩沖福爾馬林固定液（廣州維格斯生物科技有限公司生產(chǎn),批號 11011301）;TNF-αElisa試劑盒（R&D Systems公司生產(chǎn),批號295252）;IL-6 Elisa試劑盒（R&D Systems公司生產(chǎn),批號293832）;CRP Elisa試劑盒（Abcam公司生產(chǎn),批號GR78073）。

1.3 慢性萎縮性胃炎大鼠模型的建立 參考李守朝等[5-7]的慢性萎縮性胃炎大鼠模型復(fù)制方法,采用1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（MNNG）造模方法干預(yù)造模組50只大鼠,先將MNNG用蒸餾水配成1 g/L的儲存液,4℃冰箱避光冷藏保存,使用時再用飲用水配成100 mg/L濃度的溶液給大鼠自由飲用（用錫紙包裹飲水瓶）,每24 h更換1次,并記錄每日飲用溶液量,同時配合饑飽失常方法,單日足量喂食,雙日禁食。連續(xù)造模8 w后開始每隔1 w剖殺造模大鼠4只,取胃組織10%中性福爾馬林中固定后作病理檢查,觀察模型復(fù)制情況直至符合慢性萎縮性胃炎病理診斷,提示模型復(fù)制成功。造模時間約為10w?？瞻捉M自由飲水及飲食的條件下正常喂養(yǎng)。

1.4 模型建立后處理 造模成功后剩余造模組大鼠39只（造模過程中死亡3只,考慮為MNNG毒性致死;檢測模型復(fù)制情況剖殺8只）,空白組大鼠23只（病理對照剖殺2只）,隨機檢殺空白組6只、造模組6只對照觀察。剩余空白組17只、造模組33只,按隨機數(shù)字表法將造模組分為埋線組17只、模型組16只。

1.4.1 空白組 空白組自由飲水及飲食的條件下正常喂養(yǎng)。

1.4.2 埋線組 埋線組于造模成功后開始治療,選取大鼠“足三里”“中脘”“脾俞”穴,穴位的定位選取根據(jù)林文注等主編的《實驗針灸學(xué)》[8],以比較解剖和骨度分寸法為依據(jù),后三里:相當(dāng)于人體“足三里”的膝關(guān)節(jié)外側(cè)腓骨小頭下約5 mm,脛腓骨間隙中;中脘:臍上約20mm處（臍中在大鼠胸腹正中線胸骨柄上緣至外生殖連線上3/4與下1/4交界點取之）;脾俞:第十二胸椎下兩旁。穴位用碘消毒液消毒,將0.5 cm長4-0號鉻制羊腸線從6號注射針頭的針尖處裝入針體（此時注射針頭內(nèi)作為針芯的華佗牌30號1.5寸不銹鋼毫針稍退后）,線頭與針尖內(nèi)緣齊平,背腰部穴位在局部下方向上平刺,腹部斜刺、下肢穴位直刺,刺至所需深度,邊推針芯,邊退針管,將羊腸線埋植于穴位皮下組織或肌層內(nèi),線頭不外露,消毒針孔。10 d治療1次,共治療6次。

1.4.3 模型組 模型組造模成功后相同條件下正常喂養(yǎng),不治療。

1.5 治療后處理 療程結(jié)束后各組情況如下:空白組17只（檢測指標(biāo)13只,其他檢測4只）,埋線組17只（檢測指標(biāo)12只,其他檢測4只,因操作不當(dāng)死亡1只）,模型組16只（檢測指標(biāo)12只,其他檢測4只）。對3組大鼠分別按前述研究方法完成大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α含量測定,并完成實驗數(shù)據(jù)的分析處理。

1.5.1 一般狀態(tài)觀察 對各組大鼠的體質(zhì)量、毛色、精神狀態(tài)及活動情況進(jìn)行觀察、對照。

1.5.2 血清中 CRP、IL-6、TNF-α含量檢測 大鼠不禁水,禁食24 h,乙醚麻醉下,仰臥固定于手術(shù)板上,剪開腹部,抽取大鼠腹主動脈血5 mL,離心后取上清液,置-20℃冰箱保存,采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清中 CRP、IL-6、TNF-α,具體步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件處理,計量資料所有數(shù)據(jù)以（±s）表示,兩組間樣本均數(shù)的比較選用單因素方差分析,方差齊且服從正態(tài)分布采用q檢驗（SNK法）,方差齊性檢驗水平為α=0.05;否則采用非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 空白組大鼠精神良好,每日食量30～50 g,體質(zhì)量增長穩(wěn)定,毛發(fā)致密,色為白色有光澤,活動靈敏,大便呈黃黑色顆粒狀;造模組大鼠精神萎靡,平均每日食量20～40 g,體質(zhì)量增長緩慢,毛發(fā)稀疏呈萎黃色,反應(yīng)較空白組遲鈍,大便呈黑色略溏。埋線組經(jīng)治療出現(xiàn)精神好轉(zhuǎn),食欲增加,活動靈敏度增加,毛色稍黃。

2.2 大鼠胃黏膜病理學(xué)檢查

2.2.1 大體觀察 空白組大鼠胃壁彈性良好,皺襞表面光滑而規(guī)整,表面覆有較多黏液,黏膜呈淡紅色,有光澤,不見出血點;埋線組胃黏膜呈淡紅或暗紅色,皺襞較規(guī)整,有少量黏液附著,可見散在出血點,表面尚平滑。

2.2.2 光鏡下檢查 空白組:胃黏膜層厚度大,上皮細(xì)胞及腺體排列整齊,大小形狀一致,細(xì)胞呈單層柱狀,胞質(zhì)透明或空泡狀,腺體豐富與胃小凹分界清晰,固有腺及黏膜無充血、水腫,黏膜肌層無增生（圖1）。

模型組:胃黏膜層變薄,肌層增寬,胃小凹變淺,腺體變小,排列紊亂,數(shù)量減少,并有囊性擴張,間質(zhì)有纖維組織增生,及淋巴細(xì)胞浸潤,可見腸上皮化生現(xiàn)象（圖2）。

埋線組:胃黏膜均有不同程度好轉(zhuǎn)。可見胃黏膜厚度適中,腺體排列較為規(guī)則。細(xì)胞形態(tài)較均一,炎細(xì)胞浸潤主要局限于黏膜淺層,固有腺體保持相對完整。個別大鼠胃體仍有腺體萎縮等萎縮性胃炎表現(xiàn),但無明顯壞死（圖3）。

圖1 空白組（HE染色×100）

圖2 模型組（HE染色×100）

圖3 埋線組（HE染色×100）

2.3 埋線對慢性萎縮性胃炎大鼠血清C反應(yīng)蛋白CRP、IL-6、TNF-α的影響 見表 1。

表1 埋線對慢性萎縮性胃炎大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α的影響（±s）

表1 埋線對慢性萎縮性胃炎大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α的影響（±s）

注:與空白組比較:##P<0.01,#P<0.05;與模型組比較:ΔP<0.05,ΔΔP<0.01。

組 別 例數(shù) NCRP/（μ g/mL） IL-6/（pg/mL） TNF-α/（pg/mL）空白組 13 0.396 2±0.1005 13.9208±4.257 7 0.708 5±0.7819模型組 12 0.577 5±0.0951##47.439 2±25.8776## 4.110 8±3.2963#埋線組 12 0.411 7±0.0733ΔΔ 23.5325±6.709 8##Δ 1.5350±1.1776Δ

3 討論

本研究通過復(fù)制大鼠慢性萎縮性胃炎模型,采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）,觀察慢性萎縮性胃炎大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α的含量,并重點觀察穴位埋線對其的影響。研究結(jié)果提示慢性萎縮性胃炎模型大鼠血清 CRP、IL-6、TNF-α與正常相比有所升高,而穴位埋線可使大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α下降,穴位埋線對慢性萎縮性胃炎大鼠有明顯的治療作用。

C反應(yīng)蛋白（CRP）是人類重要的急性反應(yīng)蛋白,可在各種急慢性炎癥、感染、發(fā)熱、組織損傷、惡性腫瘤等疾病中增高,隨著炎癥的控制可恢復(fù),檢測CRP對于炎癥性疾病的診斷、療效觀察有重要的臨床意義,CRP的檢測方法主要分為非標(biāo)記技術(shù)和標(biāo)記技術(shù),本研究CRP主要采用標(biāo)記技術(shù)中的ELISA測定法,檢測敏感度較高。IL-6也屬于炎癥因子的一種,在炎癥中有兩方面的作用,一是保護(hù)作用,二是損傷作用,與多種疾病有關(guān)系,如感染性疾病,本研究中采用ELISA法進(jìn)行檢測。TNF-α是腫瘤壞死因子（TNF）的一種,適量的TNF-α可參與免疫細(xì)胞的活化炎癥反應(yīng),具有抗感染、抗病毒和抗腫瘤作用;而過量的TNF-α則可導(dǎo)致細(xì)胞破壞,溶酶體漏出,炎性介質(zhì)釋放,使黏膜營養(yǎng)不良,加重黏膜炎癥反應(yīng),甚至誘發(fā)機體產(chǎn)生惡質(zhì)素,導(dǎo)致癌變可能,在本研究中同樣采用ELISA法進(jìn)行檢測。CRP、IL-6、TNF-α均屬于炎癥因子,在炎癥過程中起著重要的作用,慢性萎縮性胃炎有著胃黏膜的慢性炎癥改變,同時也是胃癌癌前病變的類型,研究表明,在炎癥過程中血清CRP、IL-6、TNF-α明顯高于正常,證明慢性萎縮性胃炎大鼠有明顯的炎癥存在,而穴位埋線治療對CAG大鼠炎癥反應(yīng)有明顯抑制作用,抑制炎癥反應(yīng)可能有助于慢性萎縮性胃炎病情的改善。

本研究所選取大鼠穴位為足三里、中脘、脾俞,三者臨床常用于治療胃腸疾病。穴位埋線療法近年來在臨床中應(yīng)用非常廣泛,它屬于針灸治療方法的一種,其治病原理從中醫(yī)學(xué)角度來講是調(diào)節(jié)經(jīng)絡(luò)臟腑來治療疾病,通過本研究表明其對慢性萎縮性胃炎治療作用可能與抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)。

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