薤白對(duì)絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙大鼠的作用及機(jī)制研究*

吳相鋒，李 錚，來(lái) 靜，吳相春，，賈振華，，王宏濤，王玲玲

(1.河北醫(yī)科大學(xué)附屬以嶺醫(yī)院(國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)絡(luò)病學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，石家莊 050091);2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室(心腦血管絡(luò)病)，石家莊 050035;3.石家莊市第三醫(yī)院，石家莊 050017)

薤白為百合科蔥科植物小根蒜Allium macrostemonBunge和薤Allium chineseG·Don的干燥鱗莖，味辛、苦，性溫、無(wú)毒，具有溫中通陽(yáng)、暢通絡(luò)氣、寬胸散結(jié)之功效，為胸痹心痛之要藥?，F(xiàn)代研究表明，薤白的化學(xué)成分構(gòu)成含有多種活性成分，主要含大蒜氨酸、甲基大蒜氨酸、大蒜糖，醇提取物含有前列腺素。具有抑菌消炎、解痙平喘、抗血小板聚集作用，以及抗氧化作用、降低血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛作用［1］。本研究觀察了薤白提取物對(duì)絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙大鼠血管內(nèi)皮功能、結(jié)構(gòu)及主動(dòng)脈組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志性蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康清潔級(jí)Wistar雄性大鼠30只，體質(zhì)量200～230g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK(京)2007-0001)。

1.1.2 藥物 薤白提取物:由河北以嶺醫(yī)藥研究院提供，用0.5%CMC-Na配制成0.12g生藥/ml的混懸液，4℃保存?zhèn)溆?蛋氨酸由河北省農(nóng)科院提供，并由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制作成3%的高蛋氨酸飼料，純度 99.9%(批號(hào) B7NE-05-0007-MC02);血清一氧化氮(NO)試劑盒由南京建成生物試劑公司提供，血漿內(nèi)皮素(ET)由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供，Goldview為賽百盛公司產(chǎn)品，BCA法蛋白濃度定量試劑盒、ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒由Pierce公司提供?？勾笫驡RP78/Bip多克隆抗體由Cell Signaling提供。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠30只，將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對(duì)照組、絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙組(以下簡(jiǎn)稱模型組)和薤白組3組。參照本室的方法［2］，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)即將大鼠放入束縛盒內(nèi)，調(diào)節(jié)前端活動(dòng)部位到合適的位置，使大鼠不產(chǎn)生強(qiáng)烈反抗的緊張程度，每天6h，給予3%蛋氨酸飲食，時(shí)間為6周?？瞻讓?duì)照組給予正常飲食。

1.2.2 給藥 實(shí)驗(yàn)第1天薤白組給予薤白1.2g生藥/(kg·d)灌胃，用0.5%CMC-Na溶液配制成混懸液，其余2組按體質(zhì)量灌服0.5%CMC-Na溶液。各組喂食飼料不變，實(shí)驗(yàn)共6周，每周6次。

1.2.3 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)?zāi)?0%水合氯醛麻醉，頸動(dòng)脈取血后，迅速剪開(kāi)胸腔分離胸腹主動(dòng)脈，于主動(dòng)脈弓處取一段血管置于4%多聚甲醛溶液中固定，以備HE染色，光鏡觀察。仔細(xì)分離并截取一小段動(dòng)脈，預(yù)冷生理鹽水沖洗，迅速浸入電鏡液中，修成1mm×1mm×1mm大小組織塊，迅速置于2.5%的戊二醛固定液，用于透射電鏡觀察;每組3只大鼠無(wú)菌取主動(dòng)脈組織迅速投入液氮中，然后于－80℃凍存待測(cè)GRP78的表達(dá)。

1.2.4 血清NO、血漿ET的檢測(cè) 分離血清、血漿后凍存，硝酸還原酶法檢測(cè)血清NO(白求恩國(guó)際和平醫(yī)院完成)，放免法檢測(cè)血漿ET-1(解放軍總醫(yī)院完成)。

1.2.5 光鏡組織學(xué)觀察 常規(guī)HE染色，光鏡觀察。

1.2.6 透射電鏡組織學(xué)觀察 經(jīng)1%的鋨酸固定、割斷、酒精逐級(jí)脫水、臨界點(diǎn)干燥和離子金屬鍍膜，用日立 H-7500透射電鏡觀察、拍照(河北醫(yī)科大學(xué)電鏡室完成)。

1.2.7 Western blot法測(cè)定GRP78的表達(dá) 取血管組織經(jīng)液氮研磨后加入1ml RIPA裂解液冰上裂解 30min，4℃、3000rpm離心 20min吸取上清，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，用樣品緩沖液稀釋至7.5ug/ul。取 150ug蛋白樣品進(jìn)行 12%的 SDSPAGE凝膠電泳，待溴酚藍(lán)接近凝膠底部時(shí)停止電泳，4℃、120V恒壓電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉 1h。分別加入1∶750稀釋的 GRP78/Bip一抗和1∶500稀釋的 β-actin(內(nèi)參)一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜10min×3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1000)室溫孵育 1h，TBST洗膜5min×3次。ECL發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Quantity One軟件分析，掃描灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠之間ET、NO的變化

表1顯示，與正常對(duì)照組比較，復(fù)合模型組大鼠血漿ET明顯升高，血清NO明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)。與復(fù)合模型組比較，薤白組大鼠的 ET水平明顯降低，NO水平明顯升高(P＜0.01)。

表1 各組大鼠 ET、NO水平的變化比較(±s，n=10)

表1 各組大鼠 ET、NO水平的變化比較(±s，n=10)

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

組 別 ET(pg/ml) NO(umol/L)正常組142.91± 8.72 45.22±12.42模型組 178.25±21.85＊＊ 24.91± 9.95*薤白組 153.47± 9.36## 56.12±21.30##

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1 各組大鼠主動(dòng)脈組織光鏡的變化 圖1顯示，正常組主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜、外膜形態(tài)基本正常，結(jié)構(gòu)完整。模型組內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、分布不均勻、密度增加，內(nèi)膜有多量淋巴細(xì)胞附壁，內(nèi)膜內(nèi)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)彈力板有斷裂，平滑肌可見(jiàn)明顯水腫。薤白組可改善模型大鼠的主動(dòng)脈大體形態(tài)。

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈組織HE染色變化比較(×400)

2.2.2 各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 圖2顯示，正常組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核及細(xì)胞器存在，線粒體結(jié)構(gòu)無(wú)異常。模型組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體大部分嵴和少部分膜融合或消失，幾乎見(jiàn)不到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和吞飲小泡。薤白組可改善模型大鼠主動(dòng)脈組織內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

圖2 各組大鼠主動(dòng)脈組織內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化比較(×20000)

2.3 各組大鼠主動(dòng)脈組織GRP78蛋白表達(dá)變化

圖3顯示，與正常組比較，模型組主動(dòng)脈組織GRP78蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。與模型組比較，薤白組GRP78蛋白表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)。

圖3 各組之間GRP78表達(dá)變化

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管正常功能方面起著重要作用，內(nèi)皮細(xì)胞不僅是血液和組織間進(jìn)行交換的屏障，而且可合成和分泌多種生物活性物質(zhì)，如NO、ET。NO/ET是一對(duì)具有拮抗效應(yīng)的血管活性物質(zhì)，兩者合成釋放作用的協(xié)調(diào)是維持血管張力的主要因素之一。高同型半胱氨酸(HHcy)血癥是血管內(nèi)皮功能障礙的危險(xiǎn)因素，Hcy的氧化應(yīng)激反應(yīng)在很大程度上解釋了Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能損害，然而同樣是含硫氨基酸，半胱氨酸在體內(nèi)的濃度遠(yuǎn)高于Hcy水平，雖然半胱氨酸也能產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，但并不引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷?？寡趸瘎┤鏝-乙酰-L-半胱氨酸、維生素C、E和過(guò)氧化氫酶等均不能抑制Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，這提示可能存在除氧化應(yīng)激外的其他機(jī)制介導(dǎo)Hcy誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷。不少學(xué)者提出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激學(xué)說(shuō)［3］，在心血管系統(tǒng)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為多種應(yīng)激過(guò)程的共同通路，廣泛地參與多種心血管疾病的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，HHcy誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活［4］。GRP78是一重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，GRP78作為一種代償而增多，促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊。Hcy引起嚴(yán)重或長(zhǎng)期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以使一些參與血管病變形成的分子功能紊亂，其中包括脂質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡和炎癥的調(diào)節(jié)障礙［5］。絡(luò)氣郁滯證候能造成明顯的內(nèi)皮功能障礙，可能與主動(dòng)脈組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)［6］。

本研究應(yīng)用慢性束縛法與3%蛋氨酸飲食相復(fù)合建立絡(luò)氣郁滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合動(dòng)物模型，并用流氣暢絡(luò)藥薤白提取物進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)。結(jié)果顯示，模型組血清NO含量明顯下降，血漿ET明顯升高，主動(dòng)脈組織形態(tài)及內(nèi)皮細(xì)胞超微構(gòu)發(fā)生明顯改變，GRP78蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。薤白提取物可明顯降低復(fù)合模型大鼠血漿 ET水平，升高血清NO水平，抑制主動(dòng)脈組織GRP78蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明，模型大鼠存在明顯的血管內(nèi)皮功能障礙和主動(dòng)脈組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，薤白提取物能改善模型大鼠的血管內(nèi)皮功能，明顯抑制主動(dòng)脈組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。提示薤白提取物可能通過(guò)降低模型大鼠主動(dòng)脈組織GRP78蛋白的表達(dá)，抑制模型大鼠的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)改善模型大鼠血管內(nèi)皮功能，防止血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，詳細(xì)機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

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