AQP3在人非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

王鳳玲，張小霞，蔡棟梁

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科，黑龍江佳木斯154003)

近年來(lái)，肺癌在我國(guó)乃至全世界的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)躍居惡性腫瘤的首位，其中非小細(xì)胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌總數(shù)的85%，其5年生存率僅16%，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。然而由于肺癌早期癥狀表現(xiàn)不明顯，往往錯(cuò)過(guò)最佳診斷和治療時(shí)機(jī)，發(fā)現(xiàn)時(shí)大部分已處于中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，因此改進(jìn)肺癌的診治水平，提高患者的生存率，對(duì)改善患者預(yù)后和增加生存率具有重要意義。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組參與跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)水的膜通道蛋白家族，根據(jù)其通透性的不同又分為水通道和水－甘油通道兩個(gè)亞族，AQP3屬于后者，通透水及其他小分子物質(zhì)如甘油、尿素等，在液體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。目前已有研究證實(shí)，AQP3在多種不同來(lái)源的腫瘤中表達(dá)水平較高，尤其是在侵襲性強(qiáng)的腫瘤中。但 AQP3在肺癌中的研究甚少，本課題采用免疫組織化學(xué)方法和酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)AQP3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)特性，探討其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其作為診斷和治療肺癌的新的分子靶點(diǎn)的潛在可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

取2012－02～2013－06期間佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院收住的非小細(xì)胞肺癌手術(shù)患者術(shù)后組織標(biāo)本和血清標(biāo)本各42例為實(shí)驗(yàn)組，20例癌旁組織(距癌腫超過(guò)5cm以上的正常肺組織)及20例健康體檢者血清為對(duì)照組。非小細(xì)胞肺癌患者男24例，女18例;年齡36～87歲，平均(63±11)歲;腺癌22例，鱗癌20例;TNM分期:I、II期26例，III期16例;組織病理類(lèi)型:高、中分化19例，低分化23例。入選標(biāo)準(zhǔn):所選患者均為首次手術(shù)且達(dá)到完全性切除并經(jīng)病理學(xué)確診，術(shù)前均未接受放化療，1個(gè)月內(nèi)未接受全身或局部激素治療，未應(yīng)用過(guò)抗腫瘤藥物，排除合并有哮喘、肺囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病及不動(dòng)纖毛綜合征等其他肺部疾病的患者。均經(jīng)患者家屬知情同意。

1.2 主要試劑

兔抗人AQP3多克隆一抗，免疫組化染色試劑盒，人水通道蛋白－3 ELISA試劑盒，所需試劑均購(gòu)自天津索羅門(mén)生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

①將待測(cè)標(biāo)本統(tǒng)一切成4μm厚石蠟切片，其中每份標(biāo)本備2張切片行常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)染色。②NSCLC患者在手術(shù)治療前抽空腹靜脈自凝血2mL室溫靜置1h，離心(5000r/min)，分離血清，冷凍保存，集中用ELISA法測(cè)血清中AQP3的濃度。各步驟嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定

①免疫組化SP法:由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)判。以細(xì)胞膜或(和)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性染色。參照Ozdemir等的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，按染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評(píng)分，其中染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分;染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):染色細(xì)胞＜1/3為1分、1/3～2/3為2分、＞2/3為3分。每張切片染色程度與染色細(xì)胞數(shù)得分相乘為其最后得分，得分＜1為陰性，1～3為弱陽(yáng)性(+)，4～6為中陽(yáng)性(++)，7～9為強(qiáng)陽(yáng)性(+++);表達(dá)程度的劃分界限:(－)及(+)為陰性表達(dá)，(++)及(+++)為陽(yáng)性表達(dá)。②免疫吸附實(shí)驗(yàn):根據(jù)AQP3的標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品的OD值計(jì)算出相應(yīng)的的樣品濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用兩樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 AQP3在鱗癌中的表達(dá)(SP×400)

圖2 AQP3在腺癌中的表達(dá)(SP×400)

2 結(jié)果

2.1 AQP3在非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組患者的腫瘤組織標(biāo)本陽(yáng)性表達(dá)30/42例，陽(yáng)性率為71.43%，對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)6/20例，陽(yáng)性率為30%，兩者之間的差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 AQP3在非小細(xì)胞肺癌患者血清中的表達(dá)

血清AQP3的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組患者組為(3.53±1.39)ng/L，而對(duì)照組為(2.80±1.07)ng/L，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，兩組間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 AQP3在不同病理因素非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織內(nèi)和血清中的表達(dá)

AQP3在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平與肺癌患者的性別、年齡、吸煙情況及 TNM分期均無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)，而AQP3在腺癌中的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于鱗癌(P＜0.05)，中、高分化組的表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于低分化組(P＜0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 AQP3在肺癌患者癌組織中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

AQP3在非小細(xì)胞肺癌患者血清中的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、吸煙情況無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)，而在腺癌中表達(dá)明顯高于鱗癌(P＜0.05)，在低分化組中表達(dá)高于中、高分化組(P ＜0.05)，臨床分期為III期組的表達(dá)高于I、II期(P＜0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P ＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 AQP3在肺癌患者血清中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

3 討論

水通道蛋白是一組能介導(dǎo)水的快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的膜通道蛋白，分子量約30kDa，屬于固有蛋白家族。該蛋白能增加細(xì)胞膜的通透性，參與水的分泌、吸收以及細(xì)胞內(nèi)外平衡的調(diào)節(jié)。首次被人類(lèi)認(rèn)識(shí)的水通道蛋白是AQP1，是由Argre等鑒定人類(lèi)Rh血型抗原時(shí)于紅細(xì)胞膜上偶然發(fā)現(xiàn)的。隨著研究的不斷進(jìn)展，目前已發(fā)現(xiàn)的該家族成員已有13個(gè)，即AQP0～12，稱(chēng)為水通道蛋白家族[1，2]?，F(xiàn)對(duì)于呼吸道中AQPs的分布研究較明確的有 AQP1、3、4、5四種，其中 AQP3主要分布在氣管和支氣管的假?gòu)?fù)層上皮細(xì)胞基底膜以及部分肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞[3]。

惡性腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移除了需要蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還需要大量快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的水，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AQP在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[4]。研究表明，水通道蛋白可能參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、轉(zhuǎn)移過(guò)程[5]。有研究證實(shí)，AQP3在腫瘤細(xì)胞及腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中均表達(dá)，提示AQP3參與腫瘤的血管生成[6]。推測(cè)AQP3表達(dá)的改變可能既影響了水分子的運(yùn)輸，又影響了細(xì)胞的生命活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兩種方法檢測(cè)了AQP3在肺癌中的表達(dá)情況，肺癌患者的癌組織和血清中AQP3的表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組，其中，腺癌患者、低分化患者及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者肺癌組織中AQP3的表達(dá)水平分別高于鱗癌患者、中(高)分化患者及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。這表明在肺癌發(fā)生過(guò)程中，隨著惡性腫瘤細(xì)胞的增加，對(duì)水分子快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的需求增多，進(jìn)而AQP3的表達(dá)也隨之增加，由AQP3形成的水通道可能改變了癌變組織中細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，轉(zhuǎn)運(yùn)了大量的小分子物質(zhì)，加快了腫瘤細(xì)胞的快速增殖并向周?chē)|(zhì)浸潤(rùn)，提示AQP3在肺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起重要作用。另外，血清中AQP3水平上調(diào)是腫瘤發(fā)生過(guò)程的重要事件，也提示血清AQP3可作為肺癌診斷的輔助手段。在肺癌患者中，血清AQP3水平與TNM分期顯著相關(guān)，而在肺癌組織中AQP3表達(dá)水平與TNM分期的相關(guān)性無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這種差異提示可能血液中AQP3的變化較組織中的變化更為敏感，也可因試驗(yàn)方法不同所致，有待進(jìn)一步研究證實(shí)，研究樣本量較少也可能造成這種差異。

綜上所述，AQP3可能與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，肺組織中及血清中AQP3表達(dá)水平的檢測(cè)可能作為NSCLC的輔助診斷指標(biāo)，尤其是血清中AQP3水平的檢測(cè)具有相對(duì)無(wú)創(chuàng)、標(biāo)本易得、可動(dòng)態(tài)觀察等優(yōu)點(diǎn)，值得進(jìn)一步推廣。另外，本實(shí)驗(yàn)還提示AQP3抑制劑有待開(kāi)發(fā)。

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