骨髓單個核細(xì)胞對大鼠脊髓損傷后行為功能影響的研究

張富運，楊建華，王 蕾，趙中男，熱吉普

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨一科，黑龍江佳木斯154003)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種以損傷平面以下感覺、運動功能完全喪失為主要癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷。目前對SCI的治療仍是難點，隨著神經(jīng)生物學(xué)和干細(xì)胞技術(shù)的迅速發(fā)展，骨髓單個核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)移植治療 SCI亦取得了重要進展[1]，但其作用機制仍不清楚。生長因子是脊髓微環(huán)境的重要組成部分，其對神經(jīng)元的存活、神經(jīng)修復(fù)以及軸突生長都具有重要促進或抑制作用，其中，神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin－3，NT－3)促進損傷脊髓功能恢復(fù)是頗受肯定的[2]。為此，本實驗擬建立大鼠脊髓半橫斷模型，觀察BMMNCs在不同時間點對大鼠后肢功能及NT－3表達的影響，進而探討B(tài)MMNCs移植治療SCI的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠(長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司)120只，雌雄各半，體重180～220g。

1.2 主要試劑

兔抗鼠NT－3多克隆抗體(武漢博士德公司，批號:DB1－07E19B)，即用型SABC－POD(兔IgG)試劑盒(武漢博士德公司，編號:SA1022)，大鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，編號:LTS1083)，滅菌肝素生理鹽水。

1.3 骨髓單個核細(xì)胞的分離和計數(shù)

無菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，用注射器吸取無菌生理鹽水(含肝素鈉)沖洗骨髓腔于離心管，用Ficoll密度梯度離心法分離出BMMNCs，光學(xué)顯微鏡下臺盼蘭計數(shù)器計數(shù)，檢測細(xì)胞活性為90%，加無菌PBS液制成BMMNCs懸液，濃度調(diào)整為6×1011/L，4℃保存，2h內(nèi)移植。

1.4 模型制備和動物分組

大鼠麻醉成功后妥善固定，術(shù)區(qū)常規(guī)處理，按肋骨確定T10脊髓，行后正中切口，咬除T9～10棘突及相應(yīng)椎板，于T10椎骨平面打開椎管，充分暴露脊髓背面及兩側(cè)，用外科手術(shù)尖刀于脊髓中央動脈向左完全離斷，生理鹽水沖洗，逐層關(guān)閉術(shù)區(qū)，術(shù)后常規(guī)消毒，成功制成脊髓半橫斷模型。術(shù)后腹腔注射青霉素防感染，定時排便。120只大鼠，其中6只提取BMMNCs，剩余大鼠造模后2d死亡10只，剩余大鼠隨機分為實驗組(C組)48只，分別于橫斷面頭尾方向采用局部微量注射法注射15μL BMMNCs懸液;對照組(B組)48只，按C組的方法注射15μL PBS液;假手術(shù)組(A組)8只，僅切除對應(yīng)的椎板并按C組的方法注射15μLPBS液。

1.5 術(shù)后動物BBB評分

各組大鼠在術(shù)后1、3、5、7、14 和21d 按 BBB 評分標(biāo)準(zhǔn)[3]測試后肢功能。評定前排空膀胱，將大鼠放入一開口大盆(底部為帶條紋的地板)，輕敲盆壁，使其爬行，記錄動物肢體運動及其協(xié)調(diào)情況。

1.6 動物組織取材

各組大鼠造模成功1d、3d、5d、7d、14d和 21d取8只行BBB評分后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉;沿肋弓下緣打開腹腔，顯露心臟，用麻醉科套管針刺入左心室，拔出針芯快速灌注生理鹽水，同時將右心耳剪開放血，灌注至腸系膜血管變白為止;先快后慢灌注含4%多聚甲醛、0.1 M磷酸鹽緩沖液共500mL進行固定，迅速于脊髓斷面向頭尾各1cm處取出完整脊髓，置于4%多聚甲醛固定，4℃冰箱中保存。

1.7 NT－3檢測

組織石蠟包埋后制成矢狀切片，按免疫組化SABC試劑盒說明書操作。光學(xué)顯微鏡下以胞漿或胞核出現(xiàn)棕褐色或棕色免疫產(chǎn)物為 NT－3陽性表達。用 Leica Application Suite.V3照相系統(tǒng)在 Leica Ver3.4.0顯微鏡下攝片，Leica Qwin pro.V3.5.1圖像分析系統(tǒng)下行細(xì)胞平均灰度值測量。每張切片在損傷脊髓區(qū)隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×200)，求其灰度值進行數(shù)據(jù)分析。圖像分析系統(tǒng)檢測精度最黑為0，最亮為255。免疫陽性產(chǎn)物越多，圖像顯色越深，灰度值越小，反之，灰度值越大，陽性產(chǎn)物表達越少。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，對實驗數(shù)據(jù)采用方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分實驗結(jié)果

見表1，術(shù)后各個時間點A組后肢功能評分與B、C組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);B組和C組比較，各個時間點均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠BBB評分比較(±s，n=8)

表1 各組大鼠BBB評分比較(±s，n=8)

與A組比較，aP ＜0.05;與B組比較，bP ＜0.05。

組別1d 3d 5d 7d 14d 21d A 組 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 B 組 0.55±0.01a 0.67±0.01a 1.94±0.01a 2.81±0.02a 5.20±0.02a 7.04±0.01a C 組 0.92±0.01a，b 1.39±0.02a，b 3.17±0.01a，b 5.08±0.01a，b 6.90±0.02a，b 9.24±0.06a，b

2.2 各組大鼠受損脊髓組織中NT－3的表達

實驗結(jié)果見圖1～3，表2，圖中標(biāo)尺為100um。顯微鏡下見A、B、C三組NT－3免疫陽性細(xì)胞主要分布于灰質(zhì)，胞漿著色多見，以大運動神經(jīng)元為主，也可見染色較弱的毛刷狀陽性產(chǎn)物。表2中可見假手術(shù)組與實驗組、對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);各時間點實驗組平均灰度值與對照組比較明顯較低(P＜0.05);實驗組平均灰度值于術(shù)后1d、3d、5d、7d 逐漸下降，14d、21d 逐漸上升，即 NT －3的表達先增多，7d達高峰，隨后減少;對照組平均灰度值于術(shù)后1d、3d、5d 逐漸下降，7d、14d、21d 逐漸上升，即 NT －3 的表達亦是先增多，5d達高峰，隨后減少;各時間點實驗組平均灰度值與對照組比較明顯較低(P＜0.05)。

圖1 實驗組7d脊髓灰質(zhì)(免疫組織化學(xué)ABC法，×200)

圖2 對照組7d脊髓灰質(zhì)(免疫組織化學(xué)ABC法，×200)

圖3 假手術(shù)組脊髓灰質(zhì)(免疫組織化學(xué)ABC法，×200)

表2 各組各時點NT－3平均灰度值比較(±s，n=8)

表2 各組各時點NT－3平均灰度值比較(±s，n=8)

與A組比較，aP ＜0.05;與B組比較，bP ＜0.05。

組別1d 3d 5d 7d 14d 21d A 組 184.59±1.07 182.30±0.33 185.73±0.47 186.11±0.17 189.24±0.19 183.62±0.30 B 組 205.49±1.09a 194.25±0.03a 180.07±1.41a 184.61±0.29a 186.98±0.20a 197.33±0.08a C 組 196.13±0.46a，b 185.27±0.26a，b 174.83±0.72a，b 163.70±0.30a，b 170.12±0.46a，b 179.49±0.62a，b

3 討論

SCI是神經(jīng)系統(tǒng)一種嚴(yán)重的疾病，一旦發(fā)生，往往意味著患者喪失自理的能力，對患者家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。SCI難以修復(fù)是多因素作用的結(jié)果，其中BMMNCs移植治療SCI近年來受到臨床和科研學(xué)者的廣泛關(guān)注。BMMNCs是指骨髓中的細(xì)胞核為單個的總稱，包括造血干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，內(nèi)皮祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等，是含有多種細(xì)胞成分的細(xì)胞群。有學(xué)者證實[4～6]，BMMNCs可直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，形成新的血管;或者以自分泌或旁分泌的方式分泌促血管生長因子從而促進血管新生，骨髓單個核細(xì)胞群內(nèi)眾多不同的細(xì)胞可能在損傷脊髓的修復(fù)中起著重要的作用。和骨髓中某種純化的細(xì)胞相比，BMMNCs可提供細(xì)胞之間協(xié)助的誘導(dǎo)環(huán)境，進而為損傷脊髓修復(fù)提供更好的微環(huán)境，直接移植可防止體外擴增帶來的多元分化潛能和自動遷移性的下降[7]，BMMNCs移植治療SCI是有效的[8]，但其作用機制尚不十分清楚。

NT－3是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，有學(xué)者證明[9]其能阻止受損神經(jīng)元萎縮，提高神經(jīng)細(xì)胞的存活量，而且與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)[10]。Ding Y等[11]研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后NT－3在受損脊髓灰質(zhì)的表達量上調(diào)，說明受損脊髓對內(nèi)源性NT－3的需求增加，NT－3表達升高可改善脊髓損傷大鼠后肢功能，這可能與其能夠促進脊髓軸突再生有關(guān)[12]。

本實驗BBB評分、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示大鼠后肢功能與NT－3的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。對照組與假手術(shù)組相比:術(shù)后1d、3d的NT－3表達較少，逐漸增多的，于術(shù)后5d達峰，而后逐漸下降接近假手術(shù)組，BBB評分顯示對照組大鼠后肢功能逐漸改善，提示NT－3的表達增高可能與SCI大鼠后肢功能好轉(zhuǎn)有直接關(guān)系，這與Ding Y等的研究是一致的。實驗組與對照組相比:NT－3的表達量明顯較高，BBB評分也顯示大鼠后肢功能較好，提示BMMNCs可改善SCI大鼠的后肢功能且可能與NT－3的表達增高相關(guān)。免疫組化和BBB評分檢測表明:實驗組大鼠后肢功能與受損脊髓組織中NT－3的表達基本呈正相關(guān)趨勢，提示實驗組大鼠后肢功能的改變可能與BMMNCs移植后調(diào)節(jié)NT－3的表達有關(guān);NT－3可提高神經(jīng)元的存活，促進軸突再生，而軸突完整性是脊髓功能發(fā)揮的重要基礎(chǔ)，BMMNCs可能通過提高NT－3的表達促進軸突生長，神經(jīng)細(xì)胞存活，進而改善脊髓功能。

據(jù)上所述，BMMNCs對SCI大鼠后肢功能有改善作用，受損脊髓組織中NT－3的表達上調(diào)，進而修復(fù)損傷脊髓可能是其機制之一。但SCI恢復(fù)過程是復(fù)雜的，是多因素作用的結(jié)果，受損脊髓組織中NT－3的表達上調(diào)是否是BMMNCs改善SCI大鼠行為功能的主要機制尚需進一步研究。

[1]Moviglia GA，Varela G，Brizuela JA，et al.Case report on the clinical results of a combined cellular therapy for chronic spinal cord injured patients[J].Spinal Cord，2009，47(6):499-503

[2]Donnelly EM，Madigan NN，Rooney GE，et al.Lentiviral vector delivery of short hairpin RNA to NG2 and neurotrophin－3 promotes locomotor recovery in injured rat spinal cord[J].Cytotherapy，2012，14(10):1235-1244

[3]Pertici V，Amendola J，Laurin J，et al.The use of poly(N －[2 －h(huán)ydroxypropyl]－methacrylamide)hydrogel to repair a T10 spinal cord hemisection in rat:a behavioural，electrophysiological and anatomical examination[J].ASN Neuro，2013，5(2):149-166

[4]Sekiguchi H，Ii M，Jujo K，et al.Improved culture－ based isolation of differentiating endothelial progenitor cells from mouse bone marrow mononuclear cells[J].PLoS One，2011，6(12):28639

[5]Mees B，Récalde A，Loinard C，et al.Endothelial nitric oxide synthase overexpression restores the efficiency of bone marrow mononuclear cell－ based therapy[J].Am J Pathol，2011，178(1):55-60

[6]李長德，楊建華，劉錚，等.骨髓單個核細(xì)胞移植治療急性脊髓損傷[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，8(8):1431-1434

[7]Szivassy SJ，Bass MJ，Van Zant G，et al.Organ － selective homing defines engraftment kinetics of murine hematopoietic stem cell and is compromised by ex vivo expansion[J].Blood，1999，93，1557-1566

[8]Dedeepiya VD，Rao YY，Jayakrishnan GA.Index of CD34+Cells and Mononuclear Cells in the Bone Marrow of Spinal Cord Injury Patients of Different Age Groups:A Comparative Analysis[J].Bone Marrow Res，2012，2012:787-414

[9]Horton CD，Qi Y，Chikaraishi D，et al.Neurotrophin －3 mediates the autocrine survival of the catecholaminergic CAD CNS neuronal cell line[J].J Neurochem，2001，76(1):201-209

[10]呂洋，孫穎，陳建貴.早期干預(yù)對腦損傷仔鼠大腦中NT－3表達的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010，33(4):70

[11]Ding Y，Yan Q，Ruan JW，et al.Electroacupuncture promotes the differentiation of transplanted bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing TrkC into neuron－like cells in transected spinal cord of rats[J].Cell Transplant，2013，22(1):65-86

[12]Zhou L，Baumgartner BJ，Hill－ Felberg SJ，et al.Neurotrophin －3 expressed in situ induces axonal plasticity in the adult injured spinal cord[J].J Neurosci，2003，23(4):1424-31